Purificação De Enzimas

INTRODUÇÃO

As enzimas são encontradas na natureza em misturas complexas, geralmente as células apresentam centenas ou mais diferentes enzimas, para um estudo aprofundado deve-se purificar a enzima a ser estudada.

Em alguns casos é possível através da aplicação de métodos específicos utilizar enzimas nos estado impuro, mas na maioria dos casos, a presença de outras enzimas interfere nos substratos desviando as reações específicas.

Etapas para a purificação

1ª etapa:Obtenção do extrato bruto

Captura: isolar, concentrar eestabilizar a proteína alvo

2ª etapa:Purificação intermediária: retirar amaior parte das impurezas

3ª etapa:Polimento: remover traços decontaminantes

Tipos de cromatografia



Cromatografia de exclusão molecular

Cromatografia por troca iônica

Cromatografia por interação hidrofóbica

Cromatografia por fase reversa

Cromatografia de afinidade

EXTRAÇÃO

Isolamento inicial da amostra protéica domaterial de origem;

Lise das células/tecido de origem:

- Lise por Sonicação - Lise por pressão -Trituração do tecido

Preparação da amostra para as etapascromatográficas:



1) Adição de aditivos (Detergentes);

2) Ajuste do pH da amostra;

3) Adição de Sais;

4) Centrifugações;

5) Filtrações;

6) Diálises;

7) Etc...

Cromatografia de exclusão molecular

Separação pela Massa Molecular

Proteínas maiores eluem primeiro Menorcaminho a percorrer

Cromatografia portroca ionica

Interação reversível entre proteínas comcargas opostas à da resina

Importante técnica de caracterização equantificação de proteínas e peptídeos

Depende do pI da proteína alvo e do pHda solução

Cromatografia porinteração hidrofóbica



Interação reversível entre proteínashidrofóbicas com a resina hidrofóbica

Cromatografia por FaseReversa



Interação reversível entre proteínashidrofóbicas com a resina hidrofóbica

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Cromatografia