O Departamento de Química Analítica

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Relatório HPLC

Departamento de Química Analítica

Turma GQA00018

Prof. Marco Antonio

Levi Barreto da Luz

Niterói

12/2023

Introdução teórica

A cromatografia é baseada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que acontece de acordo com as diferentes interações entre duas fases imiscíveis. Uma é a fase estacionária, que possui uma área superficial ampla, enquanto a outra é um fluido que se move através da fase estacionária, chamada fase móvel. Na cromatografia líquida, a fase móvel é líquida.

A fase móvel utilizada na cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tem requisitos específicos impostos por esse método analítico. Uma característica fundamental é que o solvente escolhido seja capaz de dissolver a amostra sem interações químicas significativas. Além disso, é necessário que a fase móvel apresente alto grau de pureza, ou seja, facilmente purificável, garantindo análises de alta sensibilidade, uma vez que impurezas podem interferir na detecção do analito pelo ultravioleta (UV). Também é importante que a fase móvel seja compatível com detector utilizado e possua a polaridade adequada para permitir uma separação eficiente dos componentes da amostra. A coluna cromatográfica é composta por um material inerte capaz de suportar todas as pressões às quais será submetida. A capacidade da coluna é estabelecida pelo seu comprimento, diâmetro e pelo material utilizado como fase estacionária. Quando se trata de detectores, não há um que tenha todas as propriedades ideais para a CLAE. Eles não são versáteis ou universais, mas existem detectores que têm uma ampla gama de aplicações. A sensibilidade de um detector é determinada pela relação entre o sinal gerado e a quantidade de amostra que o produz. A linearidade refere-se faixa em que o sistema do detector é diretamente proporcional à concentração do soluto.

Na CLAE, os detectores mais comumente usados são os fotométricos, que se baseiam na absorbância no ultravioleta e no visível. Os detectores de fluorescência são usados como método de detecção específica e são sensíveis a substâncias que fluorescem. Esses detectores podem detectar quantidades da ordem de picograma. Além disso, os detectores de índice de refração também são empregados, os quais monitoram constantemente a diferença no índice de refração entre a fase móvel pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da amostra. A resposta destes detectores é moderada, geralmente na ordem de micrograma. Um solvente adequado na HPLC deve possuir alto grau de pureza, dissolver a fase móvel sem decomposição, ser compatível com o detector e não dissolver a fase estacionária. Também deve ser não tóxico e ter baixa viscosidade para uma separação eficiente. Solventes viscosos prejudicam a transferência de massa e a intensidade da vazão.[1]

Preparação da amostra

A preparação de amostras para análise por HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) é uma etapa crítica que impacta diretamente na precisão e sensibilidade dos resultados obtidos. Aqui estão os passos detalhados envolvidos na preparação de amostras para HPLC:

1. Escolha do Solvente:

   - Selecionar um solvente adequado para dissolver a amostra. O solvente deve ser compatível com a fase móvel do HPLC e garantir uma boa solubilidade da amostra.

2. Pesar com Precisão:

   - Pesar com precisão a quantidade correta da amostra a ser analisada. Erros na pesagem podem afetar diretamente a concentração da amostra na solução.

3. Adição do Solvente:

   - Adicionar o solvente ao vial de amostra, garantindo uma completa dissolução da amostra. Agitar para assegurar uma homogeneidade adequada.

4. Filtração:

   - Filtrar a solução para remover partículas sólidas ou impurezas que possam interferir na cromatografia. O uso de filtros de membrana com poros adequados para reter partículas indesejadas.

5. Desgaseificação:

   - Tratamento na amostra para remover bolhas de ar dissolvendo gases na amostra. Isso é especialmente importante se a presença de bolhas puder interferir na precisão da injeção e na compactação da coluna.

6. Injeção na HPLC:

   - Carregar a amostra no injetor automático da HPLC. Certificar de que a injeção seja precisa para evitar variações nos resultados.

7. Controle de Temperatura:

    - Manter a temperatura da amostra e do sistema HPLC constante, pois as variações de temperatura afetam a reprodutibilidade dos resultados.

8. Corrida de Controle:

    - Antes da análise real, realizar uma corrida de controle para verificar se o sistema está funcionando corretamente e se os picos cromatográficos estão bem resolvidos.