Relatório de aula prática da Disciplina de Laboratório de Bioquímica

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Relatório de aula prática da Disciplina de Laboratório de Bioquímica

 

 

 

PROTEÍNAS

  

 

                                

João Vitor dos Santos

Karine Sousa Dantas

Mariana Gouveia Furlan

Sylvia Patricia de Carvalho

Prof. Dr. Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez

São José do Rio Preto, 24 de outubro de 2018

1. INTRODUÇÃO

Proteína é uma molécula biológica que pode ser classificada em fibrosa e globular. A proteína fibrosa é uma cadeia longa ou uma folha de aminoácidos, enquanto a proteína globular é um tipo compacto de forma esferoidal. São polímeros compostos de aminoácidos como seu monômero, sendo cada monômero conectado por ligações peptídicas. Ligações peptídicas são ligações amida formadas entre o grupo ácido carboxílico de um aminoácido e o grupo amina de um segundo aminoácido [1].

Quando uma proteína perde sua estrutura nativa a ponto de perder sua função, diz-se que esta proteína foi desnaturada, ocorrendo, frequentemente, a precipitação da proteína em decorrência da formação de agregados proteicos. As estruturas finais observadas para a proteína desnaturada não serão exatamente as mesmas dependendo do processo de desnaturação ocorrido, e normalmente não correspondem a uma total randomização da estrutura da proteína, mas sim a estruturas parcialmente dobradas. Isso ocorre pois cada processo resulta em um tipo de interferência na estrutura proteica. Essa desnaturação pode ocorrer por alterações no ambiente como alterações na força iônica, pH extremos, ação do aumento do calor (maioria das proteínas), determinados solventes orgânicos miscíveis, como álcool ou acetona, ou de certos solutos, como a ureia e o hidrocloreto de guanidina e, ainda, pela ação de detergentes [1].

 Pode-se considerar que a desnaturação pela ação da ureia e alterações no pH, por exemplo, como sendo processos brandos, pois não quebram ligações covalentes da proteína. Altas concentrações de ureia desnaturam proteínas mesmo a temperatura ambiente, através, principalmente, do rompimento de interações hidrofóbicas e das ligações de hidrogênio da proteína, necessárias para que o núcleo de proteínas globulares seja mantido estável [1,2]. O rompimento das ligações de hidrogênio intramoleculares da proteína ocorre devido aos grupos -CO e -NH da ureia, que estabelece ligações de hidrogênio com as ligações peptídicas, resultando então no rompimento das interações da proteína e na ruptura de sua estrutura conformacional [2].

 A solubilidade dos aminoácidos é largamente dependente do pH da solução, sendo que as mudanças estruturais nestes ocorrem em diferentes valores de pH, que alteram a relativa solubilidade da molécula. Em condições ácidas ambos os grupos amino e carboxílico são protonados, e em condições básicas, ambos compartilham o grupo desprotonado [1].

O leite é uma mistura de muitos tipos de proteínas, sendo a maioria delas presentes em quantidades muito pequenas. As proteínas do leite são classificadas em três grupos principais, sendo as caseínas (80%), proteínas do soro e proteínas menores. A caseína é uma mistura heterogênea de proteínas contendo fósforo, e está presente no leite como sal de cálcio e caseinato de cálcio. A caseína é composta por centenas de aminoácidos individuais, sendo que cada um pode ter uma carga positiva ou negativa dependendo do pH do sistema (do leite). Em algum valor de pH, todas as cargas positivas e todas as cargas negativas na proteína (caseína) estarão em equilíbrio, de modo que a carga líquida na proteína será zero.  Esse valor de pH é conhecido como o ponto isoelétrico e é geralmente o pH no qual a proteína é menos solúvel [3].

Através das técnicas de salting-in e salting-out é possível estudar o comportamento de proteínas com base em sua solubilidade, na qual estas biomoléculas apresentam uma variação dependendo de seus ambientes iônicos de solução. Os efeitos de sais como o cloreto de sódio no aumento da solubilidade das proteínas são muitas vezes referidos como salting in. Quando baixas concentrações de sal são adicionadas a uma solução de proteína, a solubilidade aumenta [4]. Salting-out ocorre quando a força iônica de uma solução protéica é aumentada pela adição de um sal (sulfato de amônio, por exemplo), e com isso a solubilidade de algumas proteínas é diminuída, resultando na precipitação da proteína, enquanto outras proteínas  permanecem em solução, sendo que a maior eficácia de salting-out ocorre no ponto isoelétrico. Após precipitadas, as proteínas podem ser removidas da solução por centrifugação [1,4,5].

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1 Determinação do ponto isoelétrico da caseína

2.1.1 Extração da caseína do leite

Material:

. Leite desnatado;

. Solução de ácido acético 2 ml L-1;

. Etanol 95% (v/v);

. Éter etílico;

. Béquer de 250,0 mL, proveta de 100,0 mL, conta-gotas, funil e papel filtro.

Procedimento:

        Inicialmente, misturou-se 150 mL de água destilada e 50 mL de leite em um béquer de 250 mL. Aqueceu-se até 38 ºC e adicionou-se com o conta-gotas 1,5 mL da solução de ácido acético até o aparecimento de um precipitado abundante. Logo após, deixou-se em repouso durante 20 minutos para sedimentação da proteína e descartou-se o sobrenadante.

        Transferiu-se a caseína para dois tubos Falcon de 50 mL e centrifugou-se a 2000 rpm por dois minutos. Em seguida, descartou-se o sobrenadante e adicionou-se 20 mL de etanol ao béquer, e misturou-se bem.

        O conteúdo foi filtrado e lavado com 5 mL de éter etílico, e em seguida seco por 10 minutos na estufa a 70 ºC.

2.1.2 Preparação da solução de caseína extraída do leite

Material:

. Caseína obtida na etapa anterior;

. Hidróxido de sódio 1 mol L-1;

. Ácido acético 1 mol L-1.

Procedimento:

Pesou-se 0,51 g da caseína obtida anteriormente e adicionou-se 25 mL de água destilada para ressuspende-la. Em seguida, adicionou-se 12,5 mL da solução de hidróxido de sódio e agitou-se lentamente. Para auxiliar a dissolução houve aquecimento e após ajustou-se o pH para 7,0.