O EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO NA ATIVIDADE DA INVERTASE

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS[pic 1][pic 2]

Faculdade de Farmácia

Danielly Alves Urzêda

Jeferson Alves Lourenço

Karolyne da Silva Melo Rodrigues

Layssa Augusta de Camargo

Nelson Daudt dos Santos

Raiza Guimarães Costa

Thiago Araújo Soares

EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO NA ATIVIDADE DA INVERTASE

Goiânia

2017

Danielly Alves Urzêda

Jeferson Alves Lourenço

Karolyne da Silva Melo Rodrigues

Layssa Augusta de Camargo

Nelson Daudt dos Santos

Raiza Guimarães Costa

Thiago Araújo Soares

EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO NA ATIVIDADE DA INVERTASE

[pic 3]

Goiânia

2017

SUMÁRIO

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1-INTRODUÇÃO

As enzimas são biomoléculas as quais são responsáveis por catalisar  diferentes tipos de reações em sistemas biológicos(MOURA et al., 2007). Todas as enzimas são proteínas (mas nem toda proteína é uma enzima) lábeis, as quais podem ser inativadas e desnaturadas. As enzimas diferenciam-se das demais proteínas pelas suas propriedades catalíticas, ou seja, pela sua peculiaridade  de aumentar a velocidade de reações químicas que, caso não tivessem um catalisador, seriam extremamente lentas (PEREIRA,2015).

A velocidade de uma reação catalisada por uma enzima é dependente de vários fatores e o conhecimento da cinética de uma reação oferece pistas sobre o comportamento da enziama “in vivo” e possibilita presumir o seu mecanismo de ação (PEREIRA,2015).  

Uma reação enzimática pode ser representada da seguinte forma:

, onde E é a enzima livre, S é o substrato da reação, P é o produto e ES é o complexo enzimasubstrato (PEREIRA,2015). [pic 4]

A velocidade máxima é atingida quando a proporção [S]/[E] atinge valores suficientemente altos para saturar a enzima, ou seja, a velocidade máxima é atingida quando todas as moléculas de enzima estão ligadas ao substrato  ([ES] = [E]total). Sendo que os parâmetros KM e k2 são específicos de cada reação enzimática e de cada enzima (PEREIRA,2015).

A enzima invertase (E.C. 3.2.1.26), ou E-D-fructo-furanosidio-frutohidrolase, ou ainda sacarase, é responsável pela liberação do resíduo L-Dfructofuranosidio não-redutor, a partir da molécula de dissacarídeo (RODRÍGUEZ et al., apud MOURA et al., 2007).

O substrato preferencial da enzima invertase é a sacarose, o que  acarreta  na sua hidrólise, formando uma molécula de glicose e outra de frutose, entretanto, também, pode hidrolisar ramonose e estaquiose (Fiedurek et al., apud MOURA et al., 2007).

A enzima invertase catalisa a hidrólise da sacarose segundo a reação a seguir:

Sacarose + H2O                D-glucose + D-frutose[pic 5]

A enzima invertase é de grande importância, pois foi a primeira proteína a ser identificada como um biocatalisador e também, com base nos estudos com invertase, foram desenvolvidos os princípios fundamentais da enzimologia, como por exemplo a hipótese de chave-fechadura para atividade enzimática, a equação de Michaelis-Menten, o conceito de ponto isoelétrico e a hipótese de Briggs & Haldane a qual afirma que o complexo formado entre enzima e substrato não representa um equilíbrio como imaginavam na época, mas sim um estado estacionário (MOURA et al., 2007).

2-OBJETIVO

O presente relatório tem por objetivo submeter concentrações crescente do substrato sacarose á hidrólise, com concentração constante da enzima invertase e ainda verificar em qual concentração do substrato acontece a saturação da enzima em estudo.

3-MATERIAIS E REAGENTE

• Tampão acetato 100 mM;
• Sacarose (0,5%; 0,75%; 1,00%; 1,25%; 1,5%; 1,75%; 2,0%; 2,25% e 2,5%);
• Enzima invertase;
• DNS;
• Água destilada;
• Pipetas;
• Pêra;
• Banho-Maria;
• Termômetro;
• Tubos de ensaio;
• Estante;
• Espectrofotômetro.

4-MÉTODOS

• Primeiramente, separou-se 19 tubos de ensaio para realização do experimento, pois realizou-se o ensaio em duplicata, sendo que utilizou-se 9 concentrações distintas de sacarose (0,5%; 0,75%; 1,00%; 1,25%; 1,5%; 1,75%; 2,0%; 2,25% e 2,5%); e um teste em branco.
• Posteriormente, pipetou-se 850 µL de tampão acetato (100mM) em todos os tubos de ensaio e, em seguida, adicionou-se 100µL de sacarose, nas concentrações: 0,5%; 0,75%; 1,00%; 1,25%; 1,5%; 1,75%; 2,0%; 2,25% e 2,5%. Sendo que a cada dois tubos de ensaio pipetou-se uma concentração e ao ensaio em branco adicionou-se a sacarose na maior concentração que era a de 2,5%.
• Logo após todos os tubos de ensaio foram incubados à 50°C por cerca de 1 minuto.
• Em seguida adicionou-se 50µL da enzima invertase em cada tubo.  Ao teste em branco, ao invés da enzima invertase, adicionou-se 50µL de água destilada.
• Posteriormente deixou-se a mistura reagir por cerca 10 minutos e em seguida adicionou-se 1mL da solução de DNS.
• Logo após aqueceu-se todos os tubos em banho de água fervente por cerca de 5 minutos.
• Resfriou-se os tubos e completou-se  o volume com água destilada até atingir 8mL.
• Por último homogeneizou-se os tubos e realizou-se a leitura em espectrofotômetro à 540nm. Anotou-se os resultados para posteriormente construir o gráfico V (U/mL) x [S] (mg/mL) e calcular os valores de Km e Vmax pelos métodos de Michaelis-Menten e Linewever-Burk.

5-RESULTADOS E DISCUSSÃO

Após realizada leitura em duplicata no espectrofotômetro, obteve-se a média da absorbância para cada concentração do substrato sacarose. Os valores estão contidos na tabela 1.

[pic 6] Tabela 1: Valores de absorbância e media de cada concentração

Através das absorbâncias obtidas (tabela 2) foi construído um gráfico com equação da reta (y = 9,015x - 0,0281) para chegar ao gráfico hiperbólico de Michaelis-Menten.

X	Y
0,02	0,149
0,04	0,336
0,06	0,515
0,08	0,691
0,1	0,873

Tabela 2: Valores de absorbância da concentração da  curva de calibração do ácido dinitrossalícilico (dns)