Efeito do pH na Atividade de Enzimas Catalíticas

Universidade Estadual de Campinas

TA 514 – Bioquímica de Alimentos

Prof. Hélia Harumi Sato

Relatório Aula Prática 4

Efeito do pH na Atividade Catalítica das Enzimas

Grupo IV:

Ana Luiza Duarte     RA: 145251

Simone Oliveira        RA: 141832

Carolina Vilela          RA: 145675

1.  Introdução:

Enzimas são substâncias orgânicas específicas compostas por polímeros de aminoácidos. Essas substâncias atuam como catalisadores no metabolismo dos seres vivos (ROSAS, 2003). Assim, são chamadas de biocatalisadores. Possuem estrutura proteica globular terciária ou quaternária, termolábeis e não dialisáveis (HARGER,C; SPRADA, D; HIRATSUKA,E, 1982). Os biocatalisadores aceleram a velocidade de uma reação química termodinamicamente possível, isto é, atuam reduzindo a barreira energética dessas reações.

As enzimas são de fundamental importância em fermentação industrial, já que os processos de fermentação resultam da atividade enzimática de microorganismos.

Os valores baixos ou altos de pH podem causar desnaturação considerável e consequentemente inativação da proteína enzimática. Esses efeitos são provavelmente os principais determinantes de uma típica relação atividade enzimática-pH. Para isso as enzimas possuem uma faixa de pH ótimo de atividade , em que a atividade é máxima. A importância do conhecimento dessa faixa de pH ótimo de atividade é aplicável quando se deseja utilizar condições em que ocorra maior formação de produtos desejáveis; e também quando deseja-se para minimizar a atividade para evitar reações deteriorativas. (CONN, E.E.; STUMPF, P. K., 1972).

O pH ótimo de uma enzima é determinado incubando-se as misturas de substrato e enzima em diferentes valores de pH à determinada temperatura (ROSAS, 2003).

Por exemplo, as α-amilases salivar e pancreática são essenciais no organimos humano para hidrólise do amido dos alimentos para obtenção de glicose, energia. As α-amilases hidrolisam as ligações α-glicosídicas do amido ao acaso liberando glicose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentoses e α-limite dextrina. A atuação dessa enzima resulta em rápido decréscimo na viscosidade e diminuição do poder de coloração com solução de iodo-iodeto de potássio(LEADLAY, 1983).

1. Objetivo:

A aula prática teve como objetivo determinar a faixa de pH ótimo de atividade da α- amilase.

1. Materiais e métodos:

• Materiais:

 - Solução de α- amilase nº 2 (enzima bacteriana comercial Termamyl 120 L

diluída 1: 1000).

 - 10 tubos de ensaio contendo 0,4 mL de soluções tampão 0,1 Mol/L de diferentes valores de pH (Tampão Citrato- Fosfato 0,1 Mol/L pH 2,6 ; 3,0 ; 4,0 ; 5,0 ; 6,0 e 8,0. Tampão Borato 0,1 Mol/L pH 8,0 ; 9,0. Tampão Borato- NaOH 0,1 Mol/L pH 10,0 e 11,0).

 - Solução 1% de amido solúvel em água destilada (a suspensão de amido foi aquecida cinco minutos em ebulição e em seguida resfriados a temperatura ambiente).

 - Solução de Iodo- KI (0,3% de iodo e 3% de KI).

- Solução de HCl 0,1 Mol/L.

- Espectrofotômetro.

• Procedimento:

       Pipetou- se 0,5 mL de solução 1 % de amido solúvel nos tubos numerados contendo 0,4 mL de solução de tampão 0,1Mol/ L de diferentes valores de pH. Em seguida, os tubos foram incubados durante 10 minutos a 500 C em banho de água termostatizado para manter o equilibro da temperatura.

       Após os 10 minutos, adicionou- se 0,1 mL de solução de α- amilase nos tubos de ensaio, dando um intervalo de 30 segundos de um tubo para outro, contendo substrato em diferentes valores de pH diretamente sobre o substrato e incubou- se por mais 5 minutos a 500 C.

       Após os 5 minutos de incubação, adicionou- se 0,5 mL de HCl 0,1 Mol/L nos tubos de ensaio para que a reação fosse paralisada. Adicionou- se mais 0,1 mL de solução Iodo- KI (0,3% de iodo e 3% de KI) nos tubos de ensaio e completar o volume de 15 mL com água destilada.

      Foi preparado o tubo “branco”, pipetando 0,1 mL e solução de iodo + 14,9 mL de água destilada. Além do tubo “branco”, foi preparado o tubo “controle”, pipetando 0,5mL de solução de 1% de amido solúvel, 0,5 mL de água destilada, 0,1 mL de solução de Iodo- KI, 0,5 mL de HCl 0,1Mol/L e completou- se o volume para 15 mL com água destilada.

      Feito isso, o espectrofotômetro foi calibrado, ajustando o zero de absorbância com a solução do tubo “branco” e mediu- se a absorbância dos tubos teste e controle a 620 nm.

IV. Resultados:

A absorbância das amostras medidas no espectrofotômetro a 620 nm foi:

Efeito do pH na Atividade da α-Amilase Bacteriana
Tampões	Abs 620 nm
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 2,6	1,717
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 3,0	1,842
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 4,0	1,306
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 5,0	0,331
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 6,0	0,090
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 7,0	0,105
Borato 0,1 Mol/L pH 8,0	0,247
Borato 0,1 Mol/L pH 9,0	0,358
Borato-NaOH 0,1 Mol/L pH 10,0	0,843
Borato-NaOH 0,1 Mol/L pH 11,0	0,631
Tubo controle	2,130