O Comitê de Ética em Pesquisa

Material

Antes de tudo só especificando que este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da PUC-PR. a coleta do sangue periférico veio de dois voluntários saudáveis para obtenção da membrana de fibrina. Os participantes foram escolhidos de acordo com alguns critérios: idade entre 18 e 55 anos; mínimo de 54 kg de massa corpórea; não ser portador de doenças crônicas ou autoimunes; não ser fumante; não ter ingerido aspirina ou outros medicamentos que possam interferir no processo de coagulação nas últimas duas semanas. Os critérios de exclusão foram: estar gestante; apresentar quadro de insuficiência arterial e/ou venosa periférica; fazer uso contínuo de medicamentos anticoagulantes. As células-tronco humanas derivadas de tecido adiposo (CTDAh) foram obtidas por meio da cirurgia de lipoaspiração de um único doador, do qual foram isoladas e expandidas.

Método

Preparação das membranas de fibrina e do eluato

Foram extraídos 80ml de sangue da veia antecubital (superficial) de cada participante com o auxílio de um dispositivo, para o preenchimento de oito tubos de plástico de 10ml para coleta de sangue por vácuo, devidamente esterilizados e identificados com códigos. Os tubos não continham anticoagulantes, mas continham ativador de coágulo. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado durante 10 minutos em temperatura ambiente controlada de 20 ◦C. Depois da centrifugação, o coágulo de PRF (plasma rico em fibrina) foi retirado com o auxílio de uma pinça esterilizada e, com uma tesoura estéril, a pequena parte de células vermelhas aderidas à sua extremidade foi retirada como podemos ver nessa primeira figura. Em seguida, os coágulos foram prensados com o auxílio de uma chapa de aço inoxidável também esterilizada para retirada do soro (extração do exsudado). Obteve-se, então, a membrana de PRF q e o plasma rico em fribina. As membranas foram usadas imediatamente para obtenção do eluato, o que evitou qualquer degradação proteica, que pode ocorrer em, no máximo, 3h.

Oito membranas de PRF dos dois participantes, assim que extraídas e exsudadas, foram cortadas com auxílio de uma pinça estéril para biópsia, em três círculos de 6mm e foram colocadas em poços de placas de cultivo de 6 poços. Em seguida, foram adicionados 5ml de meio de cultura DMEM-F12 sem SBF em cada poço. Os sobrenadantes das placas foram retirados depois de 48h e transferidos para tubos de 50ml e mantidos entre 2 e 8 ◦C. Dessa forma foi obtido o eluato de cada indivíduo.

Isolamento e expansão das células-tronco derivadas do tecido adiposo humano (CTDAh)

O frasco com 50ml do tecido adiposo (TA) foi processado em um fluxo laminar, usou-se o método de digestão enzimática . Ai Nesse processo, o TA foi lavado três vezes com 150ml de solução salina fosfatada (PBS – GibcoTM Life Technologies, Grand Island, USA) e dissociado com colagenase tipo I (1mg para cada mL de gordura), durante 30 minutos em 37 ◦C, com agitação constante. Após a digestão, a parte líquida inferior foi retirada e filtrada. A suspensão celular foi centrifugada a 800 g por 10 minutos e os eritrócitos contaminantesforam removidos após a lise com um tampão pH 7,3. As células foram lavadas e filtradas novamente. com cell strainer (filtro de 40m) (BD FalconTM, BD Biosciences Discovery Labware, Bedford, USA).

As células resultantes foram cultivadas em densidade específicas. de 1 × 105 células/cm2 em frascos de cultura de T75 (TPP, Trasadingen, Switzerland) em meio DMEM-F12 (GibcoTM Invitrogen, NY, USA), suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF – GibcoTM Invitrogen, NY, USA), 1% de penicilina (100 unidades/mL) e estreptomicina (100g/ml) (GibcoTM Invitrogen, NY, USA).

As células-tronco humanas derivadas de tecido adiposo foram mantidas em estufa com 5% de tensão de CO2, 37 ◦C e 95% de umidade. ai Depois de 72h de cultivo, as células não aderentes foram removidas e descartadas. As trocas de meio foram feitas duas vezes por semana e as células foram mantidas até atingir confluência entre 80% e 90%. Em seguida, as células foram dissociadas (descoladas do fundo do frasco) com tripsina/EDTA 0,25% e replaqueadas em outros frascos de cultivo, o que caracterizou a primeira passagem (P1). Depois da terceira dissociação (P3), as células foram suspensas em meio DMEM-F12 com 15% de SFB e contadas na câmara de Neubauer.

Em estudos prévios realizados utilizando o protocolo de isolamento e expansão das CTDAh descrito, foi realizada a caracterização dos marcadores de membrana por citometria de fluxo e os ensaios de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica,caracterizando as células obtidas como células-tronco, de acordo com os critérios estabelecidos por Dominici et al., 2006

E as células condrogênicas são células mesênquimais que originam os condroblastos. CARTILAGEM HIALINA: É a cartilagem mais comum, sua matriz predomina colágeno tipo II. Sua cor é branca-azulada e translúcida.