Curva Padrão De Proteína

CÓDIGO 103018 – BIOQUÍMICA Curso: Farmácia – 2013

EXPERIMENTO: curva padrão de proteína e determinação da concentração

DATA: PROFESSOR:

EQUIPE: 3

TURMA:

Nomes Assinaturas

1

2

3

4

A prática teve como objetivo a elaboração da curva de calibração e a determinação da sensibilidade do método. Com auxilio da curva padrão ou curva de calibração do método Biureto, também objetivou-se a determinação da concentração de proteínas de uma amostra problema.

A medida da absorção de luz é um instrumento importantíssimo para a análise de muitas moléculas biológicas. A fração da luz incide absorvida por uma solução em um dado comprimento de onda esta relacionada com a espessura da camada absorvente e a concentração das espécies que observam a luz. Estas duas relações estão combinadas na lei de Lambert-Beer, que, na forma integrada, é apresentada como:

log⁡〖 Io/It=E.c.l〗

Nesta fórmula, a intensidade da luz incidente é representada por Io, a intensidade da luz transmitida é I e E é o coeficiente da absorção molar (em unidades de litros/ moles- centímetro), c é a concentração das espécies absorventes (em moles/ litro), l é a espessura da camada (em centímetros) da amostra que absorve luz. A lei de Lambert-Beer assume que a luz incidente é um feixe paralelo e monocromático e que as moléculas do solvente e do soluto estão inteiramente ao acaso. A expressão log (Io/I) é chamada “absorbância” da amostra e é designada por A.

É importante notar que cada milímetro de passo óptico da solução absorvente, em uma célula de 1 cm, absorve não uma quantidade constante, mas uma fração constante da luz incidente. Entretanto, com uma espessura fixa da camada absorvente, a absorbância A é diretamente proporcional a concentração do soluto absorvente.

O coeficiente da absorção molar varia com a natureza do composto absorvente, com o solvente e com o comprimento de onda e, também, com o pH da solução, se através do ganho ou perda de prótons, a espécie absorvente de luz esta em equilíbrio com outra espécie de espectro de absorção diferente.

Na prática as medidas da absorbância são feitas com o auxilio de um conjunto de soluções de concentrações padronizadas e cujas absorções são determinadas em um comprimento de onda fixa, empregando-se um espectrofotômetro.

Espectrofotômetro é um sistema utilizado para medir e comparar a quantidade de luz (energia radiante) absorvida por uma determinada solução, ou seja, absorbância da luz. A luz oriunda de uma fonte contínua passa por um monocromador, que seleciona uma estreita faixa de comprimentos de onda do feixe incidente. Essa luz “monocromática” passa pela amostra de comprimento b, e a energia radiante da luz emergente é medida.

Na obtenção de um espectro de absorbância, é rotina registrar o primeiro o espectro da linha base com soluções de referencia (solvente puro ou um reagente em branco) em ambas as cubetas. A absorbância da linha base é subtraída da absorbância medida da amostra para se obter a absorbância verdadeira da amostra em cada comprimento de onda.

O manuseio das cubetas deve ser feito com um papel, para impedir que as pontas dos dedos entrem em contato com as faces e manter as cubetas bem limpas. As impressões digitais dispersam e absorvem a luz.

EXPERIMENTO – PARTE 1 CURVA PADRÃO

Para o preparo da curva padrão (calibração), foram separados 6 tubos de ensaio e, em cada um, acrescentado 5mL de solução de Biureto. Em seguida, foram pipetados da seguinte maneira a solução padrão de proteínas (5mg/mL) e a água destilada:

Reagentes (mL) Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6

Solução padrão de proteínas (5mg/mL)

-

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

H2O destilada

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

-

Após o preparo das soluções, ambos os tubos, foram agitados e permanecidos em repouso por 10 minutos. Em seguida, foi realizado o cálculo da concentração, utilizando a fórmula:

C_1.V_1= C_2.V_2

Assim, foram obtidos os seguintes resultados:

TUBOS 1 2 3 4 5 6

CÁLCULO

-

5 . 0,2=

C2 . 1

5 . 0,4=

C2 . 1

5 . 0,6 = C2 . 1

5 . 0,8 = C2 . 1

5 . 1,0 = C2 . 1

CONCENTRAÇÃO

BRANCO

1 mg/ml

2 mg/ml

3 mg/ml

4 mg/ml

5 mg/ml

CURVA DE ABSORÇÃO

Continuando o experimento, foi utilizado o espectrofotômetro para determinar a curva de absorção do reagente de Biureto em presença da proteína. Todos os tubos foram analisados, sendo o tubo 1(branco) utilizado como solvente de referência (solvente puro), para calibrar/zerar o equipamento, no comprimento de onda A 540nm, antes da leitura dos demais tubos. Cada solução foi posta da cubeta e analisada separadamente. Após essa analise no espectrofotômetro foi chego nos seguintes resultados, referentes a absorbância de cada solução :

TUBO

Concentração