FASES ESTACIONÁRIAS PARA CROMATOGRAFIA DE ALTO EFICIENTE

FASES ESTACIONÁRIAS PARA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA EM FASE REVERSA (CLAE-FR) BASEADAS EM SUPERFÍCIES DE ÓXIDOS INORGÂNICOS FUNCIONALIZADOS

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Edivan Tonhi, Kenneth E. Collins, Isabel C. S. F. Jardim e Carol H. Collins*

Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13083-970 Campinas - SP

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e-mail: [e-mail]

Recebido em 24/7/01; aceito em 31/10/01

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STATIONARY PHASES FOR REVERSED PHASE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (RP-HPLC) BASED ON FUNCTIONALIZED INORGANIC OXIDE SURFACES.

Particles of porous silica or other solvent resistent inorganic oxides can be functionalized by aliphatic (e.g., C-8 or C-18) or other groups to give stationary phases for use in reversed phase HPLC. The functionalization can be done by bonding of individual groups to the surface of the support particles, by producing an organic polymeric film from pre-polymers, or by adsorbing/immobilizing pre-formed polymers on the surfaces. These three types of functionalization are reviewed.

Keywords:

HPLC; reversed phase; functionalized inorganic oxides.

INTRODUÇÃO

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica de separação que, em menos de trinta anos, passou a ser um dos métodos analíticos mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos. As razões para este crescimento estão relacionadas à sua adaptabilidade para determinações quantitativas com boa sensibilidade, a possibilidade de separar espécies não voláteis e termicamente instáveis, com destaque para a indústria farmacêutica, bem como as suas aplicações em determinações ambientais e em muitos outros campos da ciência, como o da medicina.

Dentro da CLAE, estima-se que mais de 90% dos laboratórios de análise espalhados pelo mundo utilizam pelo menos um método que aplica a modalidade de CLAE em fase reversa (FR)1. Sistemas de CLAE-FR consistem de uma fase estacionária de menor polaridade e uma fase móvel de maior polaridade, enquanto a fase normal tem as polaridades invertidas. Estas fases apresentam várias vantagens, tais como: uso de fases móveis menos tóxicas e de menor custo, como metanol e água; fases estacionárias estáveis de muitos tipos diferentes; rápido equilíbrio da coluna após a mudança da fase móvel; facilidade de empregar eluição por gradiente; maior rapidez em análises e boa reprodutibilidade dos tempos de retenção. Além disso, são muito aplicadas à separação de solutos de diferentes polaridades, massas molares e funcionalidades químicas.

O presente trabalho visa revisar as fases estacionárias de CLAE-FR com destaque para os desenvolvimentos recentes.

SUPORTES

Por mais de 30 anos a sílica tem sido o material preferido para a preparação das fases estacionárias para CLAE-FR, sendo que é mecanicamente estável à altas pressões, pode ser facilmente modificada, existe um vasto conhecimento de sua estrutura e suas propriedades e é comercialmente disponível em uma grande variedade de tamanho de partículas, formas e tamanhos de poros.

Por outro lado, as fases baseadas em sílica tendem a serem limitadas em dois aspectos importantes. Um destes aspectos está relacionado à não homogeneidade da sua superfície, que apresenta diferentes tipos de grupos silanóis2,3, os quais afetam a funcionalização e, consequentemente, o mecanismo de retenção. Os silanóis (Si-OH) são ácidos e podem interagir fortemente com vários tipos de moléculas básicas (fármacos, bio-orgânicos, etc.) e adsorvê-las. Quando a adsorção é reversível, tem-se o problema de picos largos, assimétricos e com cauda, que são difíceis de serem tratados quantitativamente, além de poderem se sobrepor ou interferirem nos picos de outros solutos que eluem com tempos de retenção similares. Muitas vezes, a adsorção pode ser irreversível e os compostos depositados na superfície cromatográfica podem restringir o transporte de massa, bloquear sítios de interação normal e criar sítios ativos não específicos, afetando o desempenho da coluna, podendo até levá-la à deterioração irreversível4.

O segundo aspecto é a instabilidade da sílica e das fases estacionárias sintetizadas baseadas em sílica, tanto frente a fases móveis ácidas como básicas. Os grupos silanóis e siloxanos (Si-O-Si) reagem com estas fases móveis, sofrendo dissolução, causando perda da fase estacionária e, eventualmente, colapso da estrutura do leito da coluna5,6. Este problema de instabilidade em soluções de pH baixo7 ou alto8-10 é muito importante em CLAE-FR, sendo que soluções com pH 2,5 ou pH 9,0 são recomendadas11 para a análise de diversos compostos contendo, em sua estrutura, grupos ácidos como carboxílicos e fenólicos e básicos como aminas e amidas, tais como os encontrados em, por exemplo, fármacos e pesticidas.

Para evitar o problema de instabilidade da fase estacionária em soluções ácidas ou básicas, existe a possibilidade de substituir a sílica utilizada como suporte. Fases estacionárias com suportes de celulose ou polímeros de estireno-divinilbenzeno12 foram as primeiras a serem testadas, mas estas fases apresentam problemas de baixa resistência às altas pressões empregadas em CLAE. Outros suportes utilizados são os óxidos inorgânicos como alumina, titânia e zircônia.

A alumina13-15 tem resistência mecânica comparável à sílica e resistência química maior, mas não é disponível comercialmente com tanta variedade. Uma vantagem da utilização da alumina como suporte é a sua estabilidade frente a fases móveis com pH acima de 12, podendo separar compostos básicos sem a necessidade de utilizar reagente par-iônico ou supressão iônica. Entretanto, uma desvantagem do seu uso ocorre na separação de ácidos carboxílicos, pois estes compostos se ligam irreversivelmente na sua superfície. Para separações com fase móvel em pH menores que 10, a alumina tem aplicação muito similar à sílica, entretanto, colunas de alumina apresentam menor número de pratos do que colunas de sílica.

A alumina não modificada é bastante utilizada como fase normal para separação de solutos fracamente polares. Em fase reversa, a alumina pode ser utilizada tanto com ligações covalentes de cadeias alquilas na sua superfície ou através de recobrimento superficial