Relatório de Tecnologia de Fermentação

INTRODUÇÃO

As enzimas, em geral, são mais estáveis em baixas temperaturas, existindo poucas delas que são mais instáveis a 0-10ºC que a 20-30ºC, devido aos tipos de ligações que unem suas subunidades. Há também grande diferença entre enzimas e sua susceptibilidade ao calor.

As enzimas termoestáveis, de maneira geral, apresentam vantagens para a aplicação na indústria, visto que processos biotecnológicos conduzidos em elevadas temperaturas têm o risco de contaminação por microrganismos mesófilos, que são a maioria em um ambiente industrial, significativamente reduzido. Por outro lado, as temperaturas mais elevadas favorecem a solubilidade de substratos e produtos, e aumentam as taxas de reação por redução da viscosidade e por aumento do coeficiente de difusão dos substratos.

Durante muito tempo, o amido foi hidrolisado quimicamente, por ação de ácidos. Esse processo, no entanto, gerava subprodutos indesejáveis, como compostos coloridos ou de "flavor", além de dificultar o controle dos teores dos produtos finais. Nos últimos 30 anos, as amilases substituíram o tratamento ácido.

A α-amilase termoestável de Bacillus licheniformis ou de Bacillus stearothermophilus hidrolisa parcialmente as ligações α-1,4, liberando maltodextrinas, com redução acentuada da viscosidade.

As condições de pH e temperatura do processamento dos xaropes, por exemplo, foram definidas de modo a evitar subprodutos indesejáveis e, principalmente, levando em consideração condições ótimas de atividade e de estabilidade das enzimas.

OBJETIVOS

Determinar a termoestabilidade da enzima α-amilase, através de diferentes tratamentos com variações de temperatura e tempo.

RESULTADOS E DISCUSSÕES

No experimento, submeteu-se a amostra da enzima α-amilase a quatro diferentes temperaturas, durante quatro diferentes tempos. Inicialmente, nomeou-se os tubos a serem utilizados e, em seguida, adicionou-se 0,2mL de solução de α-amilase diretamente no fundo doe cada tubo.

Os tubos contendo a enzima foram incubados em diferentes temperaturas e, por diferentes tempos. Após 10, 15, 30 e 60 minutos de tratamento térmico sob as temperaturas de 60ºC, 70ºC, 80ºC e banho em ebulição, os tubos foram retirados e resfriados, cada qual em seu tempo devido. Para melhor compreensão, tínhamos cerca de 4 tubos para cada temperatura; o primeiro tubo era retirado após 10 minutos sob tratamento térmico; o segundo, após 15 minutos sob tratamento térmico e, assim sucessivamente. Posterior ao resfriamento, adicionou-se 0,8mL de substrato de amido em tampão fosfato pH 6,0 (Previamente preparado e incubado a 60ºC, para a amostra de α-amilase de A. oryzae) e, incubou-se os tubos por exatos cinco minutos à 60ºC (α-amilase de A. oryzae). Em seguida, adicionou-se 0,5mL de HCl 0,1 M, para que ocorresse a paralisação da reação em cada tubo de ensaio.

Para o desenvolvimento da cor, adicionou-se em cada tubo 0,1mL de solução de Iodo-KI e, em seguida, completou-se o volume da solução com água destilada, totalizando um volume de 15mL.

Uma vez promovido o desenvolvimento da cor, mediu-se a absorbância e um comprimento de onda de 620nm. Os resultados obtidos para a absorbância de cada tubo de ensaio encontram-se na Tabela 1.

Tabela 1. Absorbância das amostras dos tubos testes.

Tempo de Tratamento	60ºC	70ºC	80ºC	Banho em Ebulição
10 minutos	0,011	0,022	0,410	0,156
15 minutos	0,021	0,018	0,459	0,502
30 minutos	0,011	0,214	0,509	-
60 minutos	0,009	0,477	0,701	-

Como uma unidade de atividade é dada por minuto por mL da enzima α-amilase, utilizou-se a seguinte fórmula para calcular os valores de atividade enzimática em U/mL, a partir dos dados da Tabela 1.

Unidade de Atividade = Absorbância do controle – Absorbância da amostra × diluição da amostra[pic 1]

         Absorbância do controle

        Com a realização dos cálculos, através da fórmula acima, obteve-se a Tabela 2, contendo as unidades de atividade em diferentes tempos e temperaturas.

Tabela 2. Unidades de Atividade.

Tempo de Tratamento	60ºC	70ºC	80ºC	Banho em Ebulição
10 minutos	48,998	47,996	12,659	35,792
15 minutos	48,087	48,361	8,197	4,280
30 minutos	48,998	30,510	3,643	-
60 minutos	49,180	6,557	-13,843	-

        A partir dos dados da Tabela 2, construiu-se os gráficos que relacionam a atividade enzimática e o tempo, em diferentes temperaturas.

        

            Gráfico 1. % Atividade Enzimática × Temperatura após 10 minutos.

[pic 2]

            Gráfico 2. % Atividade Enzimática × Temperatura após 15 minutos.