HIND IIII FUNÇÕES

Após uma explicação de toda a técnica, procedeu-se à parte prática,

preparando uma solução conforme os volumes que nos foram indicados. Foi tido

em conta o erro das micropipetas que podem provocar perdas de volumes nas

medições, bem como a economização de tempo de trabalho para a preparação de

várias amostras. Assim, para preparar dois tubos diferentes, um a branco e o

outro com a amostra, optou-se por preparar em conjunto todos os reagentes que

iriam ser utilizados em comum para ambos os tubos. Para esta medição teve-se

de multiplicar os volumes pretendidos de cada reagente pelo número de

amostras necessárias, bem como por 10% do número de amostras (erro de

perdas de volume pela micropipeta). Ou seja, no caso desta actividade,

multiplicou-se o volume de cada reagente que era pretendido adicionar em cada

tubo por 2,2 (0,2 equivale a 10% de 2 amostras) e adicionaram-se os reagentes

todos no mesmo tubo prefazendo um volume de 33 μL de mix.

 Mais especificamente, o mix desta amostra conteve todos os reagentes

comuns aos dois tubos, branco e amostra, sendo que o que os distingue é a

presença de DNA na amostra e ausência do mesmo no ensaio a branco. Assim,

para preparar o mix adicionou-se pela seguinta ordem 17,38 μL de dH2O estéril;

5,5 μL de 10x "PCR buffer"; 3,3 μL de MgCl2 (25 nM); 4,4 μL de dNTPs (2,5

nM cada); 1,1 μL de Primer CAS Ext1 (10pmol/μL); 1,1 μL de Primer CAS

Ext2 (10pmol/μL); e 0,22 μL de TAq polimerase (5 U/μL). Os dNTPs são so

conjuntos de nucleótidos necessários para sintetizar as novas cadeias de DNA e

o "PCR buffer" foi utilizado porque é uma solução tampão e teve de ser de

acordo com a polimerase que foi é utilizada. Os primers são diferentes, contêm

diferentes nucleótidos porque vão ser inseridos em diferentes zonas, foram

colocados em separado e servem para identificarem o início da nova cadeia a ser

sintetizada pela polimerase. Foi utilizada a Taq polimerase porque é uma enzima

termófila que suporta elevadas temperaturas, como já foi explicado na

introdução. A adição de MgCl2 pois o magnésio é o cofactor que activa a Taq

polimerase e, por último, a água foi adicionada para manter o meio aquoso.

 Depois do mix estar preparado, retirou-se 15 μL do mesmo para o tubo

correspondente à amostra e adicionou-se 10 μL de DNA. No outro tubo

colocou-se também 15 μL de mix e adicionou-se 10 μL de água, pois este deve

conter tudo o que a amostra tem excepto o DNA e, por isso, perfaz-se o volume

para igualar com água. É de relevar que o grupo cometeu um erro na execução

do mix, pois adicionou-se 0,5 μL de DNA no mix por engano. Isto implicou que

o mix ao ser dividido em ambos os tubos, que o tubo em branco ficasse

contaminado com 0,25 μL DNA e o tubo da amostra ficasse com mais 0,25μL do

que o suposto, prefazendo um total de 25,25μL em cada tubo.

 Após a preparação dos dois tubos de 100 μL, procedeu-se à programação

de amplicação no termociclador, conforme o que nos foi indicado e

colocaram-se no mesmo os dois tubos. Ou seja, para ocorrer a desnaturação,

programou-se uma temperatura de 94 ºC, correspondentes para um ciclo de 5

minutos, 35 ciclos de 40 segundos, e outro ciclo de 40 segundos. Para ocorrer a

hibridação, programou-se a temperatura a 56 ºC, de modo a ocorrer um ciclo de

1 minuto, 35 ciclos de 40 segundos