Bioquímica Fundamental Aula Prática 2: Western Blotting

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos

Departamento de Ciências Básicas

ZAB0361: Bioquímica Fundamental

Aula Prática 2:

Western Blotting

Docente: Prof. Dr. Marcelo de Cerqueira César

Pirassununga-SP

Maio, 2014

1. Introdução

1.1 Eletroforese em gel

É uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor massa irão migrar mais rapidamente que as de maior massa. Em alguns casos, o formato das moléculas também influi, pois algumas terão maior facilidade para migrar pelo gel.

A eletroforese normalmente é utilizada para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA.

Cada molécula de proteína se liga a um grande número de moléculas do detergente dodecil sulfato de sódio (SDS) carregado negativamente, que supera a carga intrínseca da proteína e faz com que ela migre em direção ao eletrodo positivo, quando uma voltagem é aplicada. As proteínas do mesmo tamanho tendem a migrar através do gel com velocidades similares, pois sua estrutura nativa será completamente desdobrada pelo SDS, de maneira que elas se liguem a uma mesma quantidade de SDS tendo, portanto, a mesma quantidade de cargas negativas. As proteínas maiores, com mais carga, são submetidas a forças elétricas maiores e também a um retardamento maior. Livres em solução, os dois efeitos seriam anulados, mas nas malhas do gel poliacrilamida, que age como uma peneira molecular, as proteínas maiores são retardadas muito mais do que as menores. Como resultado, uma mistura complexa de proteínas é fracionada em uma série de diferentes bandas de proteínas arranjadas de acordo com sua massa molecular. As proteínas majoritárias são facilmente detectadas corando-se as proteínas do gel com um corante como o azul Coomassie, e mesmo as proteínas menos abundantes são visualizadas em géis tratados com coloração de prata ou ouro (com o qual pequenas quantidades, como 10 ng de proteína, podem ser detectadas em uma banda).

1.2 Gel de policrilamida

A poliacrilamida também pode ser utilizada como gel para a eletroforese. A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, enquanto a bisacrilamida tem forma de "T". Misturando essas duas moléculas, temos a formação de uma "rede". Diferentes relações entre as concentrações dessa moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação.

Para preparar um gel de poliacrilamida, devem-se misturar as duas substâncias formadoras nas concentrações desejadas, colocá-las em um suporte de vidro, e adicionar Temed e S208, que atuam como catalisadores da polimerização.

1.3 Tecido muscular

Nas células musculares estriadas, os filamentos de actina e de miosina estão arranjados de maneira definida e estável no citoplasma para que possam promover a contração muscular.

O sistema actina-miosina promove outros tipos de movimentos em células não-musculares. Por exemplo, ao final da divisão celular aparece abaixo da membrana plasmática, na porção central da célula, um anel contráctil constituído de filamento de actina e miosina que promove a contração do citoplasma nessa região e leva à separação das duas células-filhas.

Na verdade, são inúmeros os movimentos promovidos pelo sistema actina-miosina, como movimentos amebóides, deslocamento de organelas no citoplasma, entre outros.

Os filamentos intermediários são encontrados em quase todos os eucariotos, mas ainda não foram vistos em fungos e outros organismos inferiores. Sua função primordial é estrutural, reforçando as células e estruturando-as em tecidos.

2. Objetivos

Separar e visualizar as proteínas das amostras de peixe através da eletroforese; calcular os pesos moleculares das proteínas separadas.

3. Materiais e Métodos

3.1. Materiais

3.1.1. Tesoura

3.1.2. Pedaço de músculo de pescado

3.1.3. Microtubo

3.1.4. Tampão Laemmli

3.1.5. Incubadora

3.1.6. Pipeta automática

3.1.7. Bandeja

3.1.8. Membrana de nitrocelulose

3.1.9. Tampão de Transferência

3.1.10. Cassete de plástico

3.1.11. Esponja de fibra

3.1.12. Papel absorvente

3.1.13. Gel

3.1.14. Membrana de nitrocelulose

3.1.15. Papel molhado

3.1.16. Clipe branco

3.1.17. Cuba

3.1.18. Solução de bloqueio

3.1.19. Anticorpo primário

3.1.20. Anticorpo secundário

3.1.21. HRP (Reagente de Detecção de Cor)

3.1.22. Água destilada

3.2. Métodos

1ª etapa:

Cortou-se com tesoura um pedaço de musculo do pescado em cerca de 0,25 x 0,25 x 0,25 cm³. Em seguida, colocou-se o músculo no microtubo do respectivo peixe contendo 200 μL do tampão Laemmli agitando por 15 vezes intensamente. Posteriormente incubou-se por 5 minutos a temperatura ambiente.

2ª etapa:

Com a pipeta automática, transferiu-se cuidadosamente o tampão homogeneizado (somente