CULTIVO DE LEVEDURAS E GERAÇÃO DE ETANOL

objetivo

O objetivo deste experimento é estudar o efeito do cultivo de leveduras aeróbicas e anaeróbias em diferentes concentrações de substrato e verificar o efeito Crabtree, ou seja, a fermentação aeróbia em elevadas concentrações de glicose, através do etanol formado.

metodologia

Inoculação de cultura pura

A partir de uma suspensão 100 g/L de fermento de panificação puro efetuou-se diluições desta em água destilada esterilizada da seguinte forma:

Figura 1 - Diluições

Em seguida transferiu-se 1ml do líquido presente nos tubos 2, 3, 4 e 5 segundo a Figura 1 para uma placa de petri, girou-se as placas para espalhar bem o liquido.

Repique do microorganismo isolado em tubos e observação ao microscópio com coloração vital

A partir das colônias formadas nas placas de petri e com o auxilio de uma alça de platina, transferiu-se uma colônia pura para um tubo de ensaio contendo 10 ml de água estéril.

Com o auxilio da alça de platina, fez-se o repique pelo método de estrias em 10 tubos contendo o meio completo para a levedura. Encubou-se por 1 semana a 30°C em estufa de incubação.

Observou-se no microscópio a formação deste material por ensaio de lâmina lamínula com azul de metileno.

Preparo do Meio de Cultura

Primeiramente preparou-se o meio de cultura. Na Tabela 1, a seguir, estão apresentados os dados dos componentes adicionados para a formação de composição do meio de cultura líquido.

Tabela 1 – Dados dos componentes adicionados para a formação do meio de cultura líquido.

Componente Concentração

Glicose 100 g/L

Extrato de levedura 10 g/L

Peptona 5 g/L

MgSO4.7H2O 0,075 g/L

K2PO4 0,5 g/L

(NH4)2SO4 5,1 g/L

Água 1 L

A concentração da glicose variou para cada grupo. Para o este experimento utilizou-se uma concentração de glicose de 100g/L.

Preparou-se 500 mL do meio de cultura e em seguida o pH foi ajustado para 4,5 com NH4OH 1M e/ou com H2SO4 1M.

Cada grupo recebeu 2 erlenmeyers de 500 mL, 1 erlenmeyer de 1 L e uma proveta de 500 mL. Transferiu-se 100 mL do meio de cultura preparado para cada erlenmeyer 500 mL e 250 mL para o de 1L. Tampou-se todos os frascos com rolha esterilizada e foi colocado alumínio. Esterizou-se em auto-clave por 30 min a 120 °C.

Inoculação

Transferiu-se o conteúdo do erlenmeyer de 1L para proveta e então cinco dos melhores tubos preparados com o repique da levedura da aula anterior foram separados. A cada um destes tubos adicionou-se 5 mL de água estéril e utilizou-se a alça de platina esterilizada para a raspagem das colônias de microrganismos formadas sobre o agar. Posteriormente juntou-se os conteúdos desses 5 tubos em um erlenmeyer 250 mL previamente esterilizado.

Preparada a solução de microrganismo, inoculou-se 10 mL dessa suspensão nos dois erlenmeyers (E0 e E24) e 25 mL na proveta (P24) de maneira a atingir a proporção de 1:10 em volume.

Determinações Analíticas

Determinação da concentração celular por massa seca

Nesta etapa, determinou-se a concentração celular das amostras (t = 24h e t = 0), com a ajuda de uma membrana de microfiltração, aparelhos para filtração á vácuo, balança analítica e estufa.

Primeiramente, pesou-se a massa da membrana de microfiltração (mm). Agitaram-se as amostras e pesou-se aproximadamente 15g de cada amostra, obtendo-se mA (massa da amostra antes da filtração). Filtrou-se á vácuo, recolhendo o filtrado para análise posterior. O sedimento foi lavado com água e foi encaminhado à estufa a uma temperatura de 80°C durante seis horas. Após este tempo de secagem as amostras foram resfriadas e pesou-se novamente a membrana, obtendo-se mE (massa da amostra após a secagem). Com os dados coletados calculou-se a concentração celular, apresentada nos resultados.

Determinação da glicose (método enzimático)

A concentração da glicose foi obtida pelo método enzimático, através da análise espectrofotométrica, utilizando uma curva de calibração que relaciona a absorvância da amostra (Abs) com a concentração da glicose (g/L). Este método baseia-se na oxidação da glicose por um agente oxidante (glicose-oxidase), formando o ácido glicônico e peróxido de hidrogênio (H2O2). O H2O2 reage formando uma substância vermelha. A concentração desta substância é proporcional à concentração de glicose na amostra

A curva de calibração foi efetuada preparando-se amostras padrão de glicose nas seguintes concentrações: 0,2; 0,4; 0,5; 0,6; 0,8; 1,0.

A análise foi realizada através da adição de 50µL de amostra em 5mL do reativo de trabalho (glicose-oxidase). A mistura foi incubada em banho termostatizado a 37°C por 10 minutos, sendo em seguida resfriada em banho de gelo. Realizaram-se as leituras de absorvância em um espectrofotômetro ajustada para o comprimento de onda de 505 nm.

Destilação

Adicionou-se 50 mL da mistura a um balão de fundo redondo de 125 mL, e a este adicionou-se uma a duas gotas de anti-espumante e perolas de ebulição. Procedeu-se com a destilação ate que fosse recolhido cerca de 40 mL de destilado, este então foi avolumado para 50 mL com água destilada e teve seu teor alcoólico determinado com o auxilio de um densímetro digital.

Resultados

Com os dados coletados experimentalmente, é possível fazer o cálculo de concentração celular por massa seca, seguindo a fórmula apresentada na Equação 1:

X=(m_E-m_m)/(m_A×〖10〗^(-3) ) (1)

Na Tabela 2 a seguir, estão representados os valores coletados experimentalmente.

 

Tabela 2 – Dados coletados experimentalmente dos cultivos.

Descrição Massa (g)

Massa de amostra antes da filtração