DIAGNÓSTICO APLICADO À MICROBIOLOGIA

CENTRO UNIVERSITÁRIO DO NORTE LaureateInternationalsUniversities ®

CURSO DE FARMÁCIA

DIAGNÓSTICO APLICADO À MICROBIOLOGIA

Manaus – AM

2013

1. INTRODUÇÃO

A ciência da Microbiologia nasceu com Pasteur e dela divergiram outras áreas cientificas, como a Genética, a Biotecnologia e a Imunologia. A Microbiologia é uma ciência com caráter phiridisciplinar. que outrora Sedillot e Pasteur designaram como a ciência dos microrganismos unicelulares microscópicos, que suigin com as primeiras observações de seres com dimensões realmente microscópicas. A sua designação deriva de três palavras: mikms (pequeno), bios (vida) e logos (ciência).

As observações do holandês, mercador de tecidos. Antony van Leeuwenhoek que nessa época já utilizava lentes para observar as fibras dos seus tecidos foram de extrema relevância para o desabrochar da Microbiologia. Ao kmgo da sua vida Leeuwenhoek construiu mais de 250 microscópios e pela primeira vez conseguiu visualizar microrganismos da oliva, da água e das fezes designando-os de “animáculos”.Nessa época imperava a ideia da geração espontânea, que defendia a teoria que partindo de matéria inerte em decomposição se originava vida de uma forma espontânea.

Louis Pasteur, considerado o génio da Microbiologia, veio demonstrar com o desenvolvimento das suas experiências que não era possível o aparecimento de microrganismos de uma forma espontânea desacreditando assim a teoria da geração espontânea. Pasteur debtou assim a sua marca e tentou desenvolver métodos para compreender as causas das doenças iníeciosas (Ferreira & Sousa, 1998).

É de salientar outros trabalhos desenvolvidos por alguns estudiosos da época, que vieram dar o seu contributo para o desenvolvimento da Microbio logia, como é o caso de John Tyndall um físico, e Ferdinand Cohn que com as suas investigações e experiências levaram a pensar na possibilidade da existência de formas termorresistentes designadas, mais tarde. por esporos.Também Josepli Lis ter. entre muitos outros, tentaram demonstrar que os microrganismos eram capazes de provocar doenças, transmitindo-se de indivíduos portadores a indivíduos saudáveis.

Robert Koch, que também ocupa um lugar de peso na Microbiologia, desenvolveu os tào conhecidos Postulados de Koch, os quais ainda hoje sào utilizados para definir a origem infeciosa de urna patologia.Mais tarde, em 1953, surge Watson e Crick que descobrem a estrutura do DNA (ácido desoxirribonucleico), fazendo assim nascer a Biologia Molecular e a Genética Molecular, as quais se aplicam também ao estudo de microrganismos.

2. OBJETIVO

Hoje em dia são cada vez mais utilizadas as técnicas de biologia molecular, no diagnóstico direto, já que, apesar de apresentarem custos mais elevados, compensam na rapidez e especificidade dos resultados.Através dos métodos de biologia molecular baseados nos ácidos nucleicos é possível detectar, identificar e caracterizar diferentes microrganismos.

Com a evolução da tecnologia, foi possível detectar e analisar os ácidos nucleicos diretamente sem amplificação utilizando técnicas como a hibridação com sondas e a amplificação de sinal pela técnica do DNA ramificado (que entretanto foi ultrapassada pela PCR-em-tempo-real).Os ácidos nucleicos podem também ser detectados diretamente após amplificação de sinal através de sistemas de amplificação de sondas e sistemas de amplificação específicos de alvo.

Os sistemas de amplificação de sondas incluem a reação de ligação em cadeia (LCR) e a reação de amplificação pela Qβ replicase.Por outro lado, os sistemas de amplificação específicos de alvo englobam a reação de polimerização em cadeia (PCR). a amplificação com remoção de cadeia (SDA), e os sistemas de amplificação baseados em reações de transcrição, que permitem a amplificação diretae específica do RNA alvo.

Com a descoberta da biologia molecular e com o desenvolvimento das metodologias associadas a esta vasta área procurou-se ultrapassar vários obstáculos relativamente ao que acontecia com as técnicas tradicionais.

Procura-se assim obter resultados mais rápidos e precisos, uma maior especificidade na deteçào de microrganismos a nível hospitalar, já que uma rápida detecção do agente patogênico implica um tratamento mais rápido e eficaz. Também na indústria alimentar, os métodos moleculares são indispensáveis no controle da qualidade dos alimentos, bem como no controlo de doenças uifeciosas.

3. METODOLOGIA PCR E MULTIPLEX PCR (CLÍNICA)

A Polimerase Chain Reaction (PCR) é uma técnica que possibilita a reprodução de milhares, milhões ou mesmo bilhões de cópias de um determinado fragmento de DNA. Através dessa técnica, uma seqüência particular de interesse pode ser amplificada (clonada), tomando-se majoritária na amostra de DNA, e assim a seqüência amplificada pode ser utilizada para outros fins (TRIUNFOL, 2003).

PCR é útil em diagnósticos para verificar a presença de um gene ou um estado mutacional de um gene específico, ou simplesmente na amplificação de um segmento específico (GRIFFITHS et al, 2002). Depois que uma seqüência é amplificada, ela pode ser separada em um experimento de eletroforese, por exemplo.

O processo de PCR utiliza múltiplos ciclos de desnaturação, anelamento com piimers e alongamento da seqüência por ação da polimerase (LIFE TECHNOLOGY, CA. 2000). Esses primers são pequenos fragmentos de DNA complementares a cada uma das extremidades da seqüência de DNA de interesse. Cada ciclo se inicia com a desnaturação da dupla-hélice do DNA, elevado a altas temperaturas (95 °C), por aproximadamente 1 minuto. Esta etapa é seguida da etapa de anelamento dos primers ao DNA molde, a temperaturas que variam de 55 °C por 1 a 2 minutos. Posteriormente ocorre a elongação de cadeia por ação da polimerase, em geral entre temperaturas de 72 °C durante 2 a 5 minutos. Então cada cadeia sofre a desnaturação novamente e se tomam moldes para mais um ciclo.

O número de ciclos, a temperatura de anelamento, o tempo