Contagem Padrão em Placas

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS I

CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

CONTAGEM PADRÃO EM PLACAS

João Pessoa PB

2018

1 INTRODUÇÃO

O leite é um alimento que é altamente consumido no mundo inteiro, representa um dos melhores modelos de alimentos sobre o ponto de vista da regulamentação. Usamos as técnicas de semeadura para a contagem em placas, na busca de determinar a qualidade do leite. Neste método, contamos o numero de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por mililitro da amostra analisada, onde determina quantos microrganismos foram capazes de se reproduzir, formando colônias, num dado meio de cultura.

As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos de um meio de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para outro meio de cultura. Esta técnica, além da identificar o tipo do microrganismo de um meio, também é importante em alguns casos sua quantificação. Assim, os microrganismos podem ser quantificados de forma direta, contando-se microscopicamente através da contagem do número de microrganismos viáveis utilizando um meio de cultura apropriado.

E, para efetuar a contagem total de bactérias numa determinada suspensão da amostra faz-se diluições decimais seriadas da amostra e inocula-se, usualmente, pela técnica de “semeadura dor profundidade” ou “semeadura por superfície”, em meios de cultura apropriados. Após o período de incubação em condições de temperatura e atmosfera adequadas faz-se a contagem do número de colônias. A diferença de uma técnica para o outra é que a técnica de “semeadura dor profundidade” coloca-se, primeiramente, a alíquota de 1ml da amostra do material a ser estudado em uma placa Petri estéril sem o meio de cultura, pois esse será colocado por cima da amostra. E, na técnica “semeadura por superfície” o meio de cultura já se encontra na placa e a amostra a ser analisada é colocada por cima do meio e são espalhados com o auxílio da Alça de Drigalsky.

Para garantir que apenas o microrganismo desejado seja semeado, são utilizadas as técnicas higienização: procedimentos que devem ser adotados visando a não contaminação de materiais, meios e culturas.

As vantagens da contagem padrão em placa são:

Somente células viáveis são contadas;

Permite o isolamento das colônias, que podem ser sub-cultivadas em culturas puras, as quais podem ser facilmente estudadas e identificadas.

No entanto, algumas desvantagens são apresentadas:

Não existe um meio que permita o crescimento de todos os microrganismos;

É necessária a incubação apropriada para permitir o desenvolvimento das colônias;

Usa-se muita vidraria e é relativamente trabalhoso;

A necessidade de muita manipulação pode originar erros nas contagens devido a erros de diluição e/ou plaqueamento.

Esta técnica pode ser realizada com o objetivo de se obter colônias isoladas (estudo qualitativo), ou de se fazer a contagem de colônias em placas (estudo quantitativo).

MATERIAL E MÉTODO

SEMEADURA EM PROFUNDIDADE

Primeiramente, fazer a higienização da área de trabalho e das mãos antes e depois de qualquer trabalho.

Trabalhar sempre na área de segurança: uma área de aproximadamente 10 cm ao redor da chama do bico de Bunsen.

Esterilizar adequadamente todo material (ex.: alças e agulhas bacteriológicas) antes e depois de seu uso, sempre aquecer da base para a ponta, evitando a formação de aerossóis.

E flambar a boca dos frascos e tubos antes e depois das inoculações, evitando a contaminação da cultura/material a ser analisado e garantindo que somente o microrganismo desejado será inoculado.

Identificar tubos e placas com número de diluição de cada um;

Colocar o PCA no micro-ondas por 4 minutos ou até ficar no estado líquido;

Higienizar a embalagem do leite para fazer o corte;

Agitar o leite em ângulo de 45° formando um arco, por aproximadamente 20 vezes, a fim de homogeneizar;

Pipetar 25 ml de leite e colocar no frasco contendo 225 ml de água peptonada, e homogeneizar; este será o 〖10〗^(-1);

Pipetar 1 ml deste 〖10〗^(-1) para o primeiro tubo que contém 9 ml de água peptonada, homogeneizar, este tubo será o 〖10〗^(-2);

Pipetar 1 ml deste 〖10〗^(-2)para o segundo tubo que contém 9ml de água peptonada, homogeneizar, este tubo será o 〖10〗^(-3);

Pipetar 1 ml deste 〖10〗^(-3)para o terceiro tubo que contém 9ml de água peptonada, homogeneizar, este tubo será o 〖10〗^(-4);

Pipetar 1 ml deste 〖10〗^(-4)para o quarto tubo que contém 9ml de água peptonada, homogeneizar ,este tubo será o 〖10〗^(-5);

Obs.: sempre que transferir o líquido ao tubo deve-se flambar a boca do tubo de ensaio ao abrir e ao fechar. E pipetar sempre próximo a chama.

Começar com o tubo mais diluído (〖10〗^(-5)), pipetar 1 ml e adicionar sobre à placa (〖10〗^(-5)) , utilizar a ultima pipeta;

Com o PCA próximo a temperatura de 46°C a 48°C, colocar o PCA na placa de Petri (〖10〗^(-5)) até cobrir toda a base da placa;

Feita esta mistura, para homogeneizar, deve se fazer aproximadamente 15 movimentos, descrevendo-se o número oito;

Esperar a solidificação por cerca de 5 minutos e inverti-as;

Com o tubo diluído (〖10〗^(-4)), pipetar 1 mL e adicionar sobre à placa (〖10〗^(-4)) ;