O Metabolismo de Lipídios

Aluna: Leidiane Barboza

Resumo do artigo  “Parallel Chemoselective Profiling for Mapping Protein Structure” publicado na revista Cell ChEMICAL Biology  em 2020.

         O artigo traz técnicas estruturais para  uma maior resolução das estruturas, protéica, fornecendo uma visão das ligações frequentemente perdidas entre a estrutura e a dinâmica da proteína. No artigo é apresentado o Parallel Chemoselective Profiling (Perfil quimiosseletivo paralelo) um método estrutural baseado em solução para caracterizar a estrutura e dinâmica de proteínas. Esse método utiliza dados de mutagênese de saturação de varredura mutacional profunda para instalar resíduos de aminoácidos com químicas específicas em posições definidas na superfície exposta ao solvente de uma proteína. As diferenças na extensão da rotulagem dos resíduos mutantes instalados são quantificadas usando espectrometria de massa direcionada, relatando o ambiente local de cada resíduo e a dinâmica estrutural. Usando o método, estudamos como os inibidores competitivos de ATP são seletivos para a conformação e como afetam a estrutura local e global e da dinâmica da Src quinase. Os resultados destacados no artigo mostram como perfil Parallel Chemoselective Profiling pode ser usado para estudar uma proteína dinâmica de múltiplos domínios e sugerindo que o método é uma adição útil ao conjunto de ferramentas relativamente pequeno de técnicas existentes de estrutura de proteína.

Nesse artigo será descrito o desenvolvimento de um método simples e geral que pode relatar sobre a acessibilidade ao solvente dos resíduos dentro de uma proteína de interesse. Integrado ao método é o uso de dados de varredura mutacional profunda (DMS) para informar a geração de múltiplas variantes de um único aminoácido de uma proteína de interesse com químicas de cadeia lateral desejadas em locais específicos. Rotulagem quimiosseletiva de um pool de DMS- variantes de proteínas guiadas em condições comparativas é usado para relatar sobre o ambiente e a dinâmica  da proteína, e um ensaio de monitoramento de reação paralela (PRM) é usado para isso a quantificação do nível de resíduo por cromatografia líquida-tan-espectrometria de massa dem (LC-MS / MS).  o '' Parallel Chemose- O método de Profiling '' permite a rápida caracterização de estrutura de proteína dinâmica sob várias condições e não requerem o uso de equipamentos altamente especializados além de LC e MS capaz de adquirir tandem de alta resolução no espectro de massa.

Para usar o método é recomendado uma criação de uma biblioteca com as formas mutante de Src cys para que se possa realizar comaração. Foi usado os inibidores seletivos de conformação 1 ou 2 foram adicionados ao Src Cys Lib em concentração de saturação trações para formar complexos Src FL ligados ao inibidor. Após a formação do complexo, IA pesado foi adicionado a uma concentração final de 50, 100 ou 200 mM. No indicadopontos de tempo, alíquotas da reação foram removidas e temperadas. A proteína foi então digerida e os peptídeos foram analisados ​​usando nosso ensaio PRM. (B e C) Razões médias de intensidade de 2-Src CysLib / 1-Src CysLib de condições selecionadas (B: curso de tempo IA pesado de 50 mM; C: ponto de tempo de 60 min para cada con-centração) mapeado no domínio quinase de extraído de PDB: 2SRC. Estruturas de cristal foram sobrepostas a gerar gráficos de pizza.Para visualizar nossos dados de perfil quimiosseletivo paralelo, primeiro gerado (2-SrcCysLib/ 1-Src CysLib) relações de intensidade do pesado peptídeos marcados com IA para cada resíduo Cys em cada ponto de tempo e concentração de IA pesada, que forneceu nove condições no total. Em seguida, mapeamos essas proporções como um mapa de calor em um cristal estrutura tal do domínio quinase de Src para facilitar a interpretação dos dados, nós sobrepomos a estrutura de cristal.

A maioria dos dados de perfil quimiosseletivo paralelo sobrepõe-se de forma constante com os experimentos  de HDX-MS  realizados, permitindo fazer avalidção cruzada do insight que foram obtidos com inibidores competitivos de ATP seletivos que afetam a estrutura e dinâmica de Src quinase.  As abordagens de marcações covalente, que acessibilidade ao solvente da cadeia lateral da sonda. A concentração mais baixa de proteína de entrada necessária para o perfil quimiosseletivo comparado com HDX-MS nos permitiu criar o perfil de uma biblioteca de Src estruturais que contêm um terminal N interagindo com a membrana, em vez da variante de truncamento otimizada para solubilidade Src 3D que foi usado em nossos experimentos HDX-MS. Além disso, quimiosseletivo paralelo forneceu uma visão de nível de resíduo na estrutura de Src e dinâmica em algumas áreas do domínio da quinase de Src onde HDX-MS mostrou efeitos mais modestos. No entanto, foram encontradas regiões no domínio quinase que não foi possível criar o perfil usando pelo método, mas que foram testados com HDX-MS. Isso deixa espaço para melhorias futuras em no fluxo de trabalho, que pode ser ajustado para aplicações específicas. 

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