Roteiro para leitura e discussão do artigo “Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors”

Roteiro para leitura e discussão do artigo 4:

“Induction of Pluripotent Stem Cells from

Adult Human Fibroblasts by Defined Factors”

Integrantes:

1- O que se sabia antes deste trabalho?

Sabia-se desde 1962 que era possível que as células retornassem a um estado anterior à diferenciação, e que mesmo diferenciadas elas continuam portando, no DNA, as informações necessárias para caracterizar outros tipos celulares. Também sabia-se desde 2006 que os fibroblastos da ponta do rabo de camundongos adultos podem ser transfectados para se transformarem em iPSCs (induced pluripotent stem cells), com a mediação de um retrovírus.

Por outro lado, sabia-se que o uso de células-tronco pode ser útil para entender mecanismos de doenças, testar novas drogas e tratar pacientes, no entanto, também carrega dilemas bioéticos.

2- Qual foi o objetivo (ou a pergunta) principal deste trabalho?

Demonstrar que a diferenciação celular humana não é uma via de mão única, e portanto pode ser revertida, ao se utilizar os fatores de Yamanaka para gerar células pluripotentes muito similares às células tronco de um embrião.

3- Qual foi a estratégia geral utilizada para abordar esta pergunta?

Os pesquisadores induziram a formação de iPSCs a partir da transfecção de fibroblastos dérmicos humanos por retrovírus contendo os genes para os fatores Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Essas células foram analisadas quanto à presença de marcadores de células-tronco embrionárias (CTEs), às atividades transcricional, epigenética e telomérica de genes específicos de CTEs. Depois, foram cultivadas para formar in vitro corpos embrionários (as três camadas germinativas), células neurais e células cardíacas e, em camundongo, um tumor de tecidos múltiplos.

Foi demonstrada a geração de células pluripotentes induzidas (iPSC) oriundas de fibroblastos dérmicos humanos com os fatores de Yamanaka: Oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Sendo assim, as células induzidas são semelhantes às células tronco-embrionárias humanas em vários aspectos, tais como a morfologia, proliferação e na atividade da telomerase. Ademais, essas células podem se diferenciar em tipos celulares das três camadas germinativas in vitro e em teratomas; tais descobertas foram fundamentais para demonstrar que iPSCs podem ser geradas por fibroblastos humanos adultos.

4 – Descreva a metodologia utilizada e os resultados obtidos em cada figura do artigo.

Figura 1.

A figura (A) é a linha do tempo para o processo de geração das iPSCs. (B) é a microscopia da configuração típica de fibroblastos dermais humanos para referência.

As células transfectadas foram postas sobre células SNL feeder, que deram nutrientes, depois suplementadas com um fator de crescimento de fibroblasto. Vistas em microscopia, algumas colônias não tinham morfologia de CTEs (C) e outras pareciam (D). As primeiras se expandiram e formaram colônias similares a CTEs em morfologia (E), citoplasma e núcleo (F), e diferenciação no centro da colônia (G), então foram chamadas iPSCs.

(H-N) mostram as marcações das iPSCs para antígenos específicos de CTEs. Apenas o antígeno de (H) não era bem expresso.

Figura 2.

1. RT-PCR de vários genes de marcadores comuns a CTEs. Estão presentes nas iPSCs em níveis similares ou superiores.

2. Western blotting, técnica em que se trituram as células e se separa suas proteínas por eletroforese. Demonstra que os níveis desses marcadores são similares entre ES e iPSCs.

3. PCR para expressão dos genes retrovirais inseridos nas iPSCs usando primers específicos. Constatou que os retrovírus foram silenciados.

4. DNA microarray para análise da expressão global de genes em iPSCs e HDFs normais. Genes associados a CTEs são igualmente mais expressos por iPSCs e CTEs em relação a HDFs.

Figura 3.

1. Análise de sequenciamento genômico por bissulfito dos promotores de genes de CTEs. Mostra se os CpGs do gene está metilado ou não em 10 linhagens celulares distintas.

2. Análise da atividade da luciferase em iPSCs, HDFs e um tumor. O gene da luciferase está downstream de promotores de CTEs e da polimerase II (para controle). Vê-se que apenas HDFs não