Relatório PCR Real Time

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técnico em biotecnologia

gabriel dagues do nascimento

PALESTRA qpcr (real time)

Biologia Molecular II

Karita Costa

Londrina[pic 3]

2015

SUMÁRIO

1.        INTRODUÇÃO        

2.        DESENVOLVIMENTO        

3.        CONCLUSÃO        

REFERÊNCIAS        

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1. INTRODUÇÃO

Em visita a Universidade Estadual de Londrina (UEL), tivemos a oportunidade de assistir a uma palestra de PCR real-time ministrada pela empresa Promega, empresa biotecnológica muito conhecida por seus trabalhos nas áreas de pesquisa.

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma das tecnologias mais poderosas da biologia molecular, onde é possível copiar ou “amplificar” milhões de vezes sequências específicas de DNA dentro de um molde utilizando oligonucleótideos de sequências específicas. O PCR real time (qPCR) é uma variação da técnica de PCR convencional, utilizado para quantificar DNA ou RNA em uma amostra, utilizando sequências específicas de iniciadores, sendo ela uma técnica muito mais rápida e sensível, permitindo o monitoramento da reação de amplificação em tempo real (ciclo a ciclo) em sistema fechado, sem interferências externas no progresso da reação.

1. DESENVOLVIMENTO

O parâmetro utilizado é o nível de sinal que reflete um aumento estatisticamente significativo sobre o sinal da linha da base, o CT, utilizado para o cálculo do número inicial de cópias de DNA.

Ela é apresentada na forma de um gráfico contendo 3 curvas (fases):

• 1ª fase: Exponencial – fase muito precisa, onde ocorre pouca variação, sendo esta, a utilizada para a obtenção dos resultados;
• 2ª fase: Linear – nessa fase começa a ocorrer uma variação nas amostras e apresenta um crescente aumento;
• 3ª fase: Platô – fase que determina o final da reação, onde nesta é obtida uma menor precisão nos resultados e uma alta variação. A técnica de PCR convencional se utiliza desta fase para a obtenção dos dados, uma vez que não é necessário se ter precisão.

Os métodos de detecção apresentados foram: os Intercalantes de DNA e as Sondas de Hidrólise. Os Intercalantes de DNA é uma técnica barata que, trabalha tendo uma afinidade por fita dupla de DNA e quando na presença delas, se intercala e se torna fluorescente, variando assim de acordo com a quantidade de DNA no meio. Sua desvantagem é a de não permitir fazer multiplex – reação com mais de uma ampliação. As Sondas de Hidrólise, que neste caso foi usado como exemplo a Sonda da Taqman, é um método de detecção com um custo mais elevado, tem a desvantagem de não poder fazer a curva de Meltin, porém sua grande vantagem é a possibilidade de se fazer multiplex.

O isolamento e extração do RNA e DNA normalmente segue com um método de extração muito eficaz, baseado no uso de reagentes como o fenol e isotiocianato de guanidina, responsável por romper as células e dissolver seus componentes, porém, mantendo a integridade dos ácidos nucleicos. Foram citados dois métodos de extração: TRIzol e Kit de extração. O TRIzol é um reagente utilizado para a isolação do RNA total, de tamanho molecular grande ou pequeno, de amostras celulares e teciduais, podendo ele também processar um grande número de amostras simultaneamente. Ele mantém a integridade do RNA devido à sua inibição de RNAases, que podem degradar a amostra. Porém seu uso exige um certo cuidado por ser um produto perigoso, podendo gerar queimaduras em quem o manipula e pode causar problemas ambientais. Os Kits de extração têm um custo menor, em comparação com o TRIzol, podendo realizar até 500 extrações em um período de tempo menor.

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