Imuno resumo artigo sobre brucella melitenses em caprinos

2.2. Animais e desenho experimental

A resposta imune mediada por células à infecção por B. melitensis foi

investigado em um grupo de cabras utilizadas para uma patogênese paralela

estudo (Higgins et al., 2017). Resumidamente, 15 fêmeas grávidas mestiças

cabras foram divididas em 4 grupos: cabras desafiadas com B. virulento

estirpe de melitensis 16 M (grupos 1 e 2, faz 1-5 e 6-9, respectivamente),

cabras desafiadas com a estirpe B. melitensis Rev. 1 (grupo 3, faz 10-13),

e controles não infectados (grupo 4, faz 14-15) (Tabela 1). Este estudo foi

realizada ao longo de dois anos com 5 cabras desafiadas em um

ano (grupo 1) e os 10 animais restantes desafiados um ano depois

(grupos 2-4). Animais não haviam sido vacinados anteriormente com qualquer

Brucella vacinas e foram soronegativos antes do desafio. Estro

ciclos dos faz foram sincronizados usando duas injeções, 10 dias

à parte, da prostaglandina F2α (Lutalyse, Zoetis, Inc.), seguida de acasalamento

para um macho fértil. Inicialmente, todos os animais estavam grávidos

exame de ultrassonografia; entretanto, 5, 7, 11 e 14 subseqüentemente

sofreram perdas fetais precoces^[a], pois essas cabras não mostraram evidência de

e não estavam grávidas na necropsia. Os animais foram transferidos para um

segurança de nível 3 de biossegurança, pelo menos uma semana antes

desafio perimental, onde eles foram alojados para o restante do

estude. Todos os animais foram alimentados com uma dieta completa peletizada e feno diariamente com

suplementos nutricionais adicionados no final da gestação. Os animais foram agrupados

alojados em salas de tamanho adequado (2-4 cabras por quarto), e todas as fases

o estudo foi conduzido considerando o bem-estar animal. Ani

Os animais foram monitorados duas vezes ao dia por um veterinário ou veterinário.

estudante e quaisquer preocupações médicas prontamente abordadas.^[b]

Os animais foram infectados por instilação de B. melitensis no

junctiva (50 μl de inóculo por olho) a 80 (grupo 1) ou 100 (grupos 2-4)

dias de gestação.^[c] A dose de infecção foi determinada por diluição em série

do inóculo em solução salina e contagem padrão de placas, que mostrou

16 M (recursos BEI, Manassas, VA, NCTC 10094) e Rev. 1 (T. Ficht,

Texas A & M University) doses de inóculo a serem 8 × 106 e 8 × 107 UFC,

respectivamente.

2.3. Coleta e processamento de amostras

Amostras de sangue foram coletadas por venopunção jugular antes

desafio e após desafio nos dias 3, 7, 14, 28 (grupos 2-4) ou

35 (grupo 1) e um dia pós-parto. Em todos os momentos,

Aproximadamente 8 ml de sangue foram coletados de cada cabra em BD^[d]

Vacutainer® CPTTM Tubos para Preparação de Células com heparina sódica e

processado para isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)

dentro do tubo através de um único passo de centrifugação. PBMCs purificados foram

ou utilizado diretamente ex vivo para quantificação de populações de células ou

foram cultivados na presença de antígeno de Brucella para quantificação de

produção de citocinas.

2.4. Marcação direta de marcadores de superfície celular ex vivo

Números de células T CD4 +, células T WC1 + γδ e monócitos CD14 +

foram medidos imediatamente após o isolamento de PBMC (os números de

determinado usando CountBrightTM Absolute Counting Beads; Molecular^[e]

Probes, Eugene, OR, EUA) como descrito abaixo. Esses tipos de células eram

identificados com anticorpos monoclonais contra CD4 ovino (clone 44.3,

AbD Serotec, Raleigh, NC, EUA), WC1 bovina (clone CC15 AbD

Serotec) e CD14 humana (clone TUK4, AbD Serotec). Anticorpos foram

conjugado com Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 488 e R-ficoeritrina

(RPE), respectivamente. Além disso, PBMCs obtidos do grupo 1 caprinos

foram selecionados para a expressão do marcador CD25 em linfócitos T

utilizando anti-CD25-RPE bovino (clone IL-A111, AbD Serotec). Um rato

O anticorpo IgG1 foi usado como um controle de isotipo correspondente para CD25. Tri-

coloração de cor foi realizada em PBMCs de cabras de todos os grupos;no entanto, o protocolo de coloração diferiu entre o grupo 1 e os grupos

2–4 PBMCs de cabras do grupo 1 foram submetidas a 20 min de incubação

com anticorpos CD4 e WC1. Estas células foram posteriormente divididas

entre 3 poços e corados com CD25, isotipo CD25 ou CD14.

Como o marcador CD25 não foi investigado em PBMCs dos grupos 2-4,

um protocolo de coloração multicor de uma única etapa poderia ser utilizado com CD4,

Anticorpos WC1 e CD14. As células coradas foram esterilizadas e preservadas

com 4% de paraformaldeído (PFA) até a citometria de fluxo ser realizada.

2.5. Cultura celular e estimulação antigênica

PBMCs foram cultivadas em meio RPMI 1640 completo por 72 h

37 ° C, 5% de CO2. Células de cada animal foram aliquotadas entre 3 poços de

uma placa de 96 poços (aproximadamente 5 × 105 células / poço) e cultivada

presença de antigénio Brucella, concanavalina A (Con A) (controlo positivo,

5 μg / ml), ou meio sozinho (controle negativo). Con Um tratamento não foi

incluído na análise de PBMCs de animais do grupo 1. Todos três

tratamentos foram utilizados nos grupos 2-4. O antigénio de Brucella foi criado por

irradiação γ (1,4 × 106 rads) de uma suspensão de B. melitensis 16 M como

vivamente descrito (Stevens et al., 1995).

Após 72 h de incubação, as células foram coradas com monoclonal

anticorpos em um processo de várias etapas. Inicialmente, os linfócitos T foram corados

com anticorpos CD4 e WC1. Estas células foram posteriormente divididas

entre vários poços para coloração ou coloração da superfície celular