A Engenharia Genética

1. Regulação DA EXPRESSÃO em procariotos:        

1. A estrutura gênica:        

DNA => Promotor – Região Codificadora –Sítio Poli A- Terminador.

Organizado em operons.

Promotor/operador – Região codificadora – Terminador.

A região operadora é reconhecida por uma proteína regulatória, e a promotora pela RNA polimerase.

RNA mensageiro policistrônico, em que a partir de um único operon apresenta vários gente para um mesmo promotor/terminador, portanto, sintetiza mais de uma proteína.

A regulação é de extrema importância pois é inviável para a célula, em termos energéticos, produzir todas as proteínas que são codificadas em seu DNA. Por isso há mecanismos de regulação, que determinam quais proteínas serão sintetizadas.        

Fatores que determinam a quantidade de cada proteína:        

Concentração de mRNA, Eficiência da tradução do mRNA e estabilidade da proteína.

Genes constitutivos = são genes que são constantemente expressos.        

Genes induzíveis = genes que sua taxa de expressão varia conforme as condições da célula.

1. Mecanismos de controle transcricional

Regulação por fatores Sigma, Sigma 70 = vegetativo, Sigma 32 = Choque térmico, Sigma 54 = metabolismo de nitrogênio. Os fatores sigma se acoplam na estrutura das RNA Polimerase.

Controle por ativadores/repressores consiste em controle positivo onde o ativador ligado facilita a transcrição, e controle negativo onde o repressor ligado inibe a transcrição.

A resposta a um sinal externo consiste em sistemas induzíveis os quais a expressão ocorre somente na presença de um inibidor, e sistemas reprimíveis onde a expressão só ocorre na ausência de co-repressor.

Regulador+repressor = sequência regulatória;

Operon lac = Promotor+Operador+b-GALACTOSIDADE+PERMEASE+TRANSACETILASE.

Na ausência de glicose ocorre o aumento do sinalizador AMP cíclico (cAMP), que ativa o CAP (que sinaliza a região promotora para o reconhecimento pela RNA Polimerase). A região reguladora é responsável pela constante produção da proteína repressora. Essa proteína repressora se liga a uma região específica da região operadora, impedindo que a RNAp faça a transcrição dos genes estruturais do operon.

Com o aumento de lactose na célula, quando essa proteína repressora entra em contato com a lactose a sua conformação é alterada e ela se desprende da região operadora, permitindo que a célula produza todas as proteínas (b-GALACTOSIDADE (lacZ)+PERMEASE(lacY)+TRANSACETILASE(lacA)), que juntas irão consumir toda a lactose presente na célula, inclusive a lactose que estava junta ao repressor, fazendo com que ele retorne para a região operadora e assim seja bloqueia novamente a transcrição.

Outra ocasião é o aumento de glicose na célula, que desativa a sinalização do CAP, que impedirá o funcionamento do operon. Portanto, o operador lac permite a adequação da bactéria aos recursos energéticos disponíveis no meio, e a Lactose é uma molécula co-repressora e indutora.

[pic 1]

A regulação do Operon consiste por exemplo na repressão do mRNA com um repressor na presença de triptofano, inibindo assim a sua expressão. Podendo ainda ocorrer por atenuação onde em baixas concentrações de triptofano o ribossomo trava na região 1, mas a transcrição prossegue, mesmo com formação de grampo; já em altas concentrações de triptofano, o grampo se forma nas regiões 3 e 4, sinalizando a terminação da transcrição.

Regulação em procariotos consiste numa resposta direta a variações nas condições nutricionais, reprimindo e ativando genes, e a transcrição pode ainda ser acoplada a tradução.

1. Organização e Regulação DA EXPRESSÃO em eucariotos

1. Organização gênica em eucariotos

A relação tamanho e complexidade quando se trata de genomas deve ser cuidadosamente especificada pois o maior não significa mais complexo nem vice e versa, nem o menor por sua vez, menos complexo.

Interrupção da sequência de genes:

DNA=> Exon1-Intron1-Exon2-Intron2-Exon3……

Transcrito primário=> apresenta introns e exons.

RNAm=> apresenta apenas exons.

Genes apresentam famílias, podendo assim ser encontrados em organismos muito diferentes, genes de famílias similares, podendo ter função relacionada, ou não. Além disso, existem os genes em múltiplas cópias – clusters, que são resultado da duplicação de genes.

O Dna é organizado em cromossomos, enrolado em histonas (octâmeros) e compactado.        

1. Controle da expressão gênica em eucariotos

Dogma da biologia celular=> DNA->RNA->Proteína

Os sinais podem ser diversos para que ocorra o início do controle de expressão, mudanças nutricionais e ambientais (estímulos externos geralmente não afetam eucariotos, sendo as células do fígado uma exceção, que sintetizam enzimas para converter aminoácidos em glicose caso falte carboidratos na alimentação do indivíduo). Podem ser sinais também os hormônios ( esteroides – penetram, peptídeos geralmente são receptores). Hormônios geralmente funcionam desbloqueando os sítios ativos, ex a RNA polimerase II.

Os pontos de controle são: ativação da estrutura do gene, iniciação da transcrição, processamento da transcrição e a tradução do mRNA.

Ativação da estrutura do gene ocorre após a RNAp deslocar os octâmeros. O DNA pode ter assim, algumas formas, como cromatina que é uma forma que não possibilita a ação de proteínas reguladoras e nucleossomos (DNA de eucariotos se apresenta ligado à proteínas) que são remodelados durante a ativação gênica.

Os tipos de cromatina: a Heterocromatina fortemente condensada não é disponível para transcrição e a Eucromatina é parcialmente disponível para a transcrição.

O primeiro mecanismo de controle da regulação gênica ocorre por meio da acetilação e desacetilação das histonas. A acetilação das histonas contribuem para a ativação da transcrição. Histonas acetilases (HAT) acetilam a Lys da cauda N-Terminal das Histonas, pois reduz a afinidade da Histona pelo DNA, afrouxa o nucleossoma, recruta outros componentes da maquinaria de transcrição e Inicia a remodelagem da cromatina.

O processo de transcrição também pode ser um estágio de controle, pois existem sequências reguladoras nos promotores, exemplo Seq. Consenso conservada (Região -35) e TATAbox (região -10), sendo as 2 separadas por 17 nucleotídeos e o primeiro nucleotídeo (+1) é geralmente uma purina (A ou G), lembrando que a eliminação dessas regiões bloqueia a transcrição.