A Insulina Recombinante

Insulina Recombinante

1. Isolamento do Gene

     A Tecnologia do DNA recombinante (rDNA) Moléculas de DNA artificial contendo segmentos covalentemente ligados, derivados de duas ou mais fontes, são chamados de DNAs recombinantes. A Tecnologia do rDNA envolve modificação direta do DNA, de forma a alterar características do organismo vivo ou introduzir novas características. O isolamento dos genes de interesse é conduzido por meio de técnicas de clonagem molecular que consistem em induzir um organismo vivo a amplificar a sequência de DNA de interesse, em sistemas que permitem uma fácil purificação e recuperação do referido fragmento de DNA. Para isso, são utilizados vetores de clonagem, nos quais a sequência de DNA de interesse é inserida, utilizando a enzima DNA ligase. Quando necessário, o fragmento de DNA de interesse pode ser libertado do vetor por meio de enzimas de restrição. Uma vez isolado o gene de interesse, estes fragmentos de DNA são incorporados no genoma do organismo alvo, resultando em um organismo geneticamente modificado, cuja característica adquirida passa a ser hereditária. A clonagem do DNA envolve a separação de um gene específico e sua ligação a uma molécula de DNA transportadora e depois a replicação deste DNA modificado, o resultado é uma amplificação seletiva de um gene particular. A bactéria Escherichia coli foi o primeiro organismo usado para o trabalho do rDNA e ainda é a célula hospedeira mais comum. A clonagem de um segmento de DNA acarreta cinco procedimentos gerais: cortar o DNA no local preciso (enzimas de restrição), unir dois fragmentos de DNA covalentes (DNA ligase), selecionar uma pequena molécula de DNA capaz de auto-replicação (vetores de clonagem), um método para transferir o DNA recombinante para uma célula hospedeira e selecionar as células hospedeiras que contenham o DNA recombinante. Os métodos usados para realizar estas tarefas e outras relacionadas são conhecidos como Tecnologia do DNA recombinante.
     Muito importante para a tecnologia do rDNA são as enzimas, usadas para fragmentar o DNA deixando extremidades de fitas simples de DNA que permitem a ligação dos fragmentos. Assim, o DNA bacteriano pode recombinar com DNA humano ou de qualquer outra espécie, abrindo a possibilidade de clonar genes humanos ou isolar proteínas de culturas bacterianas. Uma importante consequência da especificidade destas enzimas de restrição é que o número de clivagens feito por cada uma delas no DNA de qualquer organismo é definido e permite o isolamento de fragmentos deste DNA.
    Para a clonagem de um determinado segmento de DNA, as enzimas de restrição mais utilizadas são aquelas que geram fragmentos com extremidades de fita simples complementares de até quatro nucleotídeos de comprimento, denominadas extremidades coesivas. Fragmentos de DNA contendo extremidades coesivas complementares podem ser unidos pela DNA ligase, que catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster entre as duas moléculas. DNA ligase requer um agrupamento OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um agrupamento fosfato na extremidade 5' da outra cadeia.

1. Inserção e controle de bactérias transformadas

Após o isolamento de uma informação genética, por exemplo, um fragmento de DNA obtido pela clivagem com enzimas de restrição, poderá ser inserido numa outra molécula de DNA diferente, capaz de amplificar aquela informação genética em centenas de cópias. Este processo de amplificação é obtido através do uso de moléculas de DNA que são os chamados vetores de clonagem molecular (Rodrigues, 2003). Esses vetores é que transportam o inserto de DNA para dentro da célula hospedeira, onde ele poderá ser replicado. A molécula de rDNA é introduzida dentro de uma célula hospedeira apropriada. O processo de introdução de DNA em células é chamado de transformação. A célula hospedeira contendo uma única molécula de rDNA, divide-se várias vezes, formando uma colônia de células derivadas da célula hospedeira original. Cada célula da colônia possui, ao menos, uma cópia da molécula recombinante. Essas células são chamadas de transformantes ou células transformadas. Tais transformantes são, normalmente, distinguidos das células que não receberam a molécula de DNA recombinante pela presença de um gene marcador, presente no DNA do vetor de clonagem. Todos os vetores de clonagem devem conter sequências que permitam a sua replicação autônoma dentro da célula hospedeira, além disso, os vetores mais úteis possuem pelo menos um sítio único de clonagem, que é um sitio de restrição que não se repete na molécula, permitindo a inserção sítio-específica de uma outra molécula de DNA. Alguns vetores contêm sítios únicos para várias endonucleases de restrição posicionados lado a lado, em um segmento denominado de sítio múltiplo de clonagem.

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