RELATÓRIO AULA PRÁTICA ELETROFORESE EM GEL

INTRODUÇÃO

A eletroforese é uma técnica de separação de proteínas utilizando-se de forças eletromagnéticas e eletriendosmóticas presentes no sistema. As frações separadas são visibilizadas a partir de corante sensível a proteínas. Os resultados devem ser sempre expressos de forma percentual e de concentração das diversas frações e em forma gráfica.

Inicialmente o processo pede que o DNA do organismo em estudo seja quebrado em pedaços que possam migrar na eletroforese, isto pode ser feito mecanicamente (por nebulização, por exemplo), ou com o uso de enzimas de restrição). O resultado será sempre um conjunto muito grande de fragmentos com tamanhos diferentes, que formarão uma faixa (mancha de arraste) borrada no gel, quando tentamos verificar o resultado da corrida eletroforética. Os fragmentos de DNA, normalmente negativos, vão correr para o pólo positivo.

O menor dos produtos migra mais rápido e gera a banda mais em baixo no gel. Em geral o gel de agarose separa bem fragmentos entre 150 pb e 1000 pb. Fora desta faixa pode ser necessário usar um gel de poliacrilamida.

O gel de agarose vai separar os fragmentos de DNA aproximadamente de acordo com seus tamanhos. Ao ser aplicado um campo elétrico entre um lado e o outro do gel, as amostras vão atravessar o gel. Após a eletroforese o DNA é desnaturado (através da adição de NaOH ou de outros produtos químicos adequados); o uso de um tampão 3M NaCl estabiliza a desnaturação.

OBJETIVOS

Aprender técnicas de checagem, quantificação e fragmentos de DNA;

Compreender os princípios da eletroforese em gel de agarose;

Checar diferentes tamanhos de fragmentos de DNA.

MATERIAIS, DILUENTES E EQUIPAMENTOS

1 g de Agarose.

1 Frasco Erlenmeyer de 250 mL.

1 Espátula.

1 pedaço 15 x 15 cm de papel alumínio.

2 L de Tampão de eletroforese TEB 1X (Tris-base 89 mM, Ácido bórico

1 luva térmica.

5 L Brometo de etídeo (1mg/mL) ou GelRedTM

2 pares de Luvas descartáveis.

Placa para gel.

Pente com 12 dentes para formar as canaletas (slots).

Bancada especial para a preparação do gel.

10 L de Tampão de amostra.

1 pedaço 6 x 3 cm de Parafilm.

10 ponteiras (Tip) para micropipeta de 50-200 L autoclavadas.

10 ponteiras (Tip) para micropipeta de 5-20 L autoclavadas.

1 estante de bancada para Eppendorfs

Óculos ou máscara de proteção contra raios UV

1 recipiente para descarte do gel com brometo de etídeo/GelRedTM

1 espátula para remoção do gel de agarose.

1 recipiente para descarte dos Tips contaminados com brometo de etídeo.

MÉTODOS

Nesta aula prática observamos as técnicas de checagem, quantificação e fragmentos de DNA, foi realizada uma eletroforese em gel de agarose e foram observados os tamanhos dos fragmentos de DNA, tudo de acordo com o roteiro da aula pratica.

PROCEDIMENTOS

1. Pesar 1g de agarose. Adicionar 100 mL de TEB 1X (agarose 1%).

2. Aquecer a mistura no forno de microondas até a agarose dissolver totalmente;

3. Resfriar a mistura em água corrente; Adicionar 5L de brometo de etídeo (1mg/mL) ou do corante GelRedTM. Usar luvas quando trabalhar com brometo de etídeo, pois este composto é mutagênico (cuidado também com a vidraria e outros materiais).

4. Homogeneizar bem, passar a mistura para o aparato e colocar o pente para a formação das fendas onde serão aplicadas as amostras;

5. Esperar aproximadamente 30 minutos até a solução de agarose solidificar;

6. Remover o pente cuidadosamente. Transferir o gel para a cuba de eletroforese com auxílio de espátula apropriada.

7. Adicionar o tampão de eletroforese TEB 1X até cobrir todo o gel.

8. Preparar as amostras para aplicar no gel: misturar 6L de cada amostra de DNA a 3L de Tampão de amostra

9. Aplicar cada preparação em um slot do gel. Obs.: No 1º slot colocar um padrão de peso molecular (Ladder).

10. Submeter ao gel uma diferença de potencial elétrico, conectando-o a uma fonte de energia (100V).

11. Acompanhar a migração da solução de azul de bromofenol até que o corante atinja a metade do gel (1 a 2 horas).

12. Submetê-lo a uma fonte de luz ultravioleta (transiluminador) para posterior visualização do DNA. Proteger os olhos. o preparo da amostra

No microtubo lader