Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Mecanismo de polimerização

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

Mecanismo de polimerização

Géis de Poliacrilamida são formados pela co-polimerização de acrilamida e bis-acrilamida (N’N’-methylene-bis-acrylamide). A reação é iniciada através de um sistema de geração de um radical livre. A polimerização é iniciada pelo TEMED (tetramethylethylenediamine) e persulfato de amônio. O TEMED acelera a velocidade de formação de radicais livres do persulfato e este cataliza a polimerização. Radicais livres do persulfato convertem os monômeros de acrilamida a radicais livres os quais reagem com monômeros inativos em crescimento iniciando a reação de polimerização em cadeia. As cadeias do polímero são ligadas ao acaso pela bis-acrilamida, resultando em laços fechados e uma complexa rede de polímero com porosidade característica, a qual depende da condição de polimerização e concentração de monômero.[pic 1]

Determinação de peso molecular

A determinação do peso molecular de proteínas por SDS-PAGE é um procedimento amplamente empregado. A mobilidade da proteína em gel de SDS_PAGE está relacionada com seu peso molecular. A curva padrão é construída com proteínas de peso molecular conhecido plotando-se os logaritmos de seu peso molecular versus a mobilidade relativa da proteína. A mobilidade relativa da proteína de peso molecular desconhecido é então ajustada na curva para determinar seu peso molecular.

A figura 1 mostra uma curva típica plotando log de peso molecular versus mobilidade relativa para um grupo de padrões de proteínas de SDS-PAGE. O valor do intercepto y marcado é 115.000, análise determinada por regressão linear. A exclusão limite aproximada do gel é de 115.000 daltons. O valor do intercepto y deve ser considerado aproximado porque depende da molibidade relativa dos padrões de proteínas usados.

[pic 2]

[pic 3]

Embora o valor do intercepto y possa ser diferente para toda porcentagem do gel, e um pouco diferente para todos padrões ajustados, o valor deveria ser altamente reproduzível de gel para gel se a mesma porcentagem de gel e os mesmos padrões forem usados. Deste modo, monitorando o intercepto y e o log do peso molecular/mobilidade relativa é uma excelente avaliação de reprodutividade e técnica de polimerização.

 

Preparação das amostras de músculo:

• Adicionar 150 μL de tampão em cada microtubo (sem rosca) rotulado com o nome dos respectivos pescados.
• Cortar com tesoura um pedaço de cada músculo do pescado cerca de 0,25 x 0,25 x 0,25 cm3

• Agitar os microtubos por 15 vezes intensamente.

• Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.

• Transferir cuidadosamente o tampão (sem o musculo) para outro microtubo (tampa com rosca) com o nome dos respectivos pescados.

• Colocar os microtubos com o tampão dos pescados para incubar durante 5 minutos a 95ºC

1. Preparação do GEL DE SEPARAÇÃO 0.375M Tris, pH 8,8

Cuidado! Usar luvas no manuseio com AA/BIS.

OBS: (Preparação para 2 mini géis)

	12%*
Água deionizada	3.35 ml
1.5M Tris-HCl, pH 8.8	2.5 ml
SDS 10% - estoque	100 μl
Acrilamida/Bis (estoque 30%)	4.0 ml
Persulfato de amônio 10%	50 μl
TEMED	5 μl

*Para proteínas tratadas com SDS de peso molecular de aproximadamente 10-100Kd.

2. Preparação do GEL DE EMPILHAMENTO – 0.125M Tris, pH 6.8

OBS: (Preparação para 2 mini géis)

	4%
Água deionizada	3,04 mL
0.5M Tris-HCl, pH 6.8	1,25 mL
SDS 10% - estoque	50 μL
Acrilamida/Bis (estoque 30%)	664 μL
Persulfato de amônio 10%	25 μL
TEMED	5 μL