RT-PCR para avaliação das enzimas e mediadores lipídicos

RT-PCR para avaliação das enzimas e mediadores lipídicos:

A avaliação do RNAm para as enzimas cicloxigenases 1 e 2 (COX1,COX2), lipoxigenases (5-LO e 12-LO) e proteína ativadora da 5-LO (FLAP), nos macrógados estimulados ou não com Sm29 será realizada pela técnica do RT-PCR. Resumidamente, será adicionado 0,5 mL de Trizol às placas de culturas após a retirada do sobrenadante para a lise celular e extração do RNA, em seguida será realizada uma extração com clorofórmio, precipitação e lavagem do RNA. Após a extração, as amostras serão avaliadas quanto à pureza por espectrofotometria e mantidas sob congelamento a -70ºC até a conversão em DNA complementar (cDNA). O cDNA é então gerado a partir do RNA purificado usando Transcriptase reversa e primers hexâmeros aleatórios. O cDNA será utilizado para a reação de RT-PCR usando uma mistura de polimerase, tampão e nucleotídeos e SYBRgreen para o qual são adicionados iniciadores personalizados para quantificar a expressão da expressão de proteínas e controle endógeno. A comparação dos padrões de expressão será realizada utilizando o método de Ct comparativo, através da equação 2-ΔΔCt, onde ΔCt corresponde ao valor de Ct do gene alvo subtraído do Ct do gene endógeno, e ΔΔCt corresponde ao valor de ΔCt de cada condição subtraído da mediana do ΔCt do grupo controle.

Para dosar as PGs e LTs. A gente precisa de Kit de ELISA. Nao sao baratos, a gente pode pegar o sobrenadante e fazer depois si a gente tem resultados legales com a RT-PCR.

Olá Luciana,

Eu estava lendo todo o projeto, aqui eu envio algumas coisas em espanhol.

Eu pensei em um parágrafo para adicionar na introdução, eu coloco as referências com o código PubMed. Não sei muito português para escrever corretamente. Seria necessário escrever melhor, desculpe. Existem artigos interessantes sobre macrófagos e asma.

Parágrafo da introdução.

Os macrófagos alveolares desempenham um papel importante no tecido pulmonar. PMC4470379 .Não foram descritos diferentes subtipos de macrófagos PMCID: PMC3944738 e também analisadas as diferentes funções destes subtipos de células em PMCID asma: PMC3600198 PMCID: PMC5070104. os mediadores lipídicos, tais como prostaglandinas, leucotrienos e lipoxinas regular a inflamação, tais como a sua resolução PMID: 24656045 PMCID: PMC4922532 e analisado o seu envolvimento na asma PMID: 27582398 PMID: 27712768

Devido à ação reguladora do sistema imune sm29, analisar a expressão de enzimas em macrófagos de pessoas asmáticas ajudaria a determinar o mecanismo de tal regulamentação

Quanto ao método

D.8 Isolamento de dois monócitos e diferenciação em macrófagos

Pode ser necessário modificar o protocolo de desprendimento de macrófagos, a idéia de placas de teflon que eu gosto, embora eu nunca as use. e seria necessário verificar com pelo menos o azul de Trypan a viabilidade das células ao contá-las. Na minha experiência, não é fácil separar os macrófagos. E, como um controle positivo de ativação clássica, eu também incluo IFN gamma.

Experiência:

Tomar a arn dos macrófagos na presença e ausência de sm29 e avaliar a expressão de enzimas relacionadas à produção de mediadores lipídicos

Reagentes:

Eu acho que poderíamos usar os mesmos reagentes que estão sendo utilizados pelo departamento até agora para realizar PCR em tempo real. Não vejo o significado de usar os outros.

Trizol (invitrogen)

Kit de coluna para limpar o RNA

Transcriptase reversa

Dna Polymerase Mix com SYBRgreen

 6 Primers para detectar proteínas

COX-1, COX-2, 12-LO, 15-LO, 5-LO, FLAP