A Nature Covid Metodologia

3.1. Produção de antígenos solúveis e obtenção de anticorpos policlonais

3.1.1. Produção de antígeno solúvel de verme adulto de Schistosoma mansoni (SWAP)

        Camundongos BALB/c fêmeas entre 8 e 10 semanas de idade, adquiridos no Centro de Bioterismo do ICB/UFMG, foram infectados, através de exposição cutânea, com 100 a 150 cercárias de S. mansoni cepa LE. Com o intuito de recuperar os vermes adultos de S. mansoni, após 45 dias, os animais foram sacrificados, por deslocamento cervical, e submetidos à perfusão do sistema porta-hepático usando solução salina (1,17% NaCl) acrescido de 50 U/L de heparina (Smithers & Terry, 1965). Estes foram lavados três vezes com 0,15 M de tampão fosfato salina pH 7,2 (0,15 M PBS) e conservados a –20oC.

        Em seguida, os vermes adultos de S. mansoni foram submetidos a trituração mecânica em potter e o macerado centrifugado a 37,000 rpm por 1 hora a 4oC (Ultracentrífuga Sorvall OTD5B, rotor T875). O sobrenadante recuperado, SWAP, teve seu conteúdo protéico determinado pelo método de Bradford (Bradford, 1976) e alíquotas armazenadas a –70oC.

3.1.2. Produção de antígeno solúvel de Escherichia coli XLOLR

        Células de E. coli XLOLR foram inoculadas em 100 mL de meio Lúria Bertani (LB) e cultivadas à 37°C, sob agitação constante (150 rpm), até a fase estacionária. Esta cultura foi centrifugada a 1,000 × g por 10 minutos e a massa de células retida foi recolhida em 10 mL de 0,1 M de borato de sódio pH 8,0 contendo 1 M de NaCl. A suspensão de E. coli foi incubada com 5 mg de lisozima à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, foi acrescentado ao extrato de 0,1 mg de DNAse I pancreática e 20 μL de Triton X-100 e este foi incubado a 4°C por 1 hora. O lisado celular foi centrifugado a 1,000 × g por 10 minutos e o sobrenadante recolhido teve o pH ajustado para 9,0 com 1 N de NaOH. O antígeno solúvel de XLOLR foi aliquotado e acondicionado a -20 °C.

3.1.3. Produção de Antígeno Solúvel de Fago λ

        Uma amostra de 1 μL de fago λ foi adicionada à 200 μL de suspensão de E. coli XLOLR, homogeneizada e incubada a 37°C por 15 minutos. Em seguida, esta suspensão foi adicionada a 3 mL de meio LB ágar 0,75%, homogeneizada e distribuída uniformemente sobre meio LB ágar 1,5% em placa de petri. A placa foi incubada a 37°C por 16 horas e, após este período, foram adicionados 4 mL de tampão SM (0,05 M de Tris-HCl contendo 10 mM de MgSO4∙7H2O e gelatina 0,01. A placa foi incubada sob agitação constante a 4°C por 12 horas. O tampão SM contendo o fago λ foi recolhido e acondicionado com clorofórmio a 4°C.

3.1.4. Obtenção de mistura de anticorpos anti-SWAP de pacientes humanos com esquistossomose

        Alíquotas de soros humanos provenientes de pacientes, de ambos os sexos e diferentes faixas etárias, que apresentavam quadro clínico de esquistossomose na fase clínica devidamente confirmados por equipes médicas e técnicas responsáveis através de exames médico – laboratoriais, foram reunidas em uma única amostra conservada a –20oC.

Os doadores foram conscientizados de que o sangue coletado seria utilizado em pesquisa básica com o intuito de aprofundar o conhecimento sobre a esquistossomose e que esta colaboração não lhes traria retorno imediato.

A metodologia foi aprovada pela Comissão de Ética do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais.

3.1.5. Produção de imunoglobulinas policlonais anti-SWAP em coelho

        Um coelho New Zeland (Oryctolagus cuniculus) com 3 meses de idade, adquirido junto à escola de Veterinária da UFMG, foi imunizado com SWAP. O procedimento de imunização consistiu de três injeções intramusculares, intercaladas por um período de 15 dias, com 200 μg de antígeno em emulsão com adjuvante completo de Freund (Sigma) na primeira imunização e nas subsequentes com adjuvante incompleto de Freund (Sigma).

        Amostras de sangue foram obtidas por punção da veia auricular antes de cada injeção. Quinze dias após a terceira imunização, o sangue total foi obtido através de punção cardíaca e o soro armazenado a –20oC. A reatividade dos soros obtidos foi monitorado através de ensaios de ELISA.

3.1.6. Acoplamento de SWAP à resina CNBr Sepharose-4B

        O acoplamento de SWAP à resina CNBr Sepharose-4B (Sigma) foi realizado conforme protocolo fornecido pelo fabricante.

3.1.7. Precipitação de imunoglobulinas humanas com sulfato de amônio

        As imunoglobulinas da mistura de soros de pacientes foram precipitadas adicionando-se solução saturada de sulfato de amônio (concentração final de 50% v/v).

        Foi adicionado à mistura de soros humanos, resfriado a 4°C e sob agitação constante, igual volume de solução saturada de sulfato de amônio. Após 1 hora de descanso em banho de gelo, esta mistura foi centrifugada a 5,000 × g a 4°C por 10 minutos. O precipitado foi ressuspendido completamente em solução de 50% de sulfato de amônio e centrifugado novamente. Este procedimento foi repetido mais duas vezes. Em seguida, as imunoglobulinas precipitadas foram solubilizadas em água deionizada, dialisadas contra 0,15 M PBS e acondicionadas a –20°C.