CONSTRUÇÃO DE UMA RETA - PADRÃO DE PROTEÍNAS

CONSTRUÇÃO DE UMA RETA - PADRÃO DE PROTEÍNAS

Relatório 2                        Turno: P4      Grupo: 2

Autores: Letícia Vitorino (10150328), Liliana Gomes (10150), Mara Pitrez (10150348), Maria Inês Oliveira (10150367)

Data de entrega: 14/03/2015

I. Introdução teórica e objetivos

O trabalho laboratorial permitiu-nos a construção de uma reta-padrão para proteínas bem como analisar a diferença entre uma reta deste tipo e curva de calibração.

A reta-padrão dá-nos o intervalo de linearidade em que o nosso estudo é válido, enquanto que uma curva de calibração é a união de vários pontos considerando todas as variações.

A preparação das soluções-padrão é que nos vai permitir a construção desta reta, sendo que uma solução-padrão é aquela cuja concentração é conhecida e como tal permite a construção de um gráfico de absorvância por concentração do qual acedemos à reta e à sua respetiva equação.

O método utlizado foi novamente o método da espectrofotometria. O espectrofotometro é um instrumento de análise, capaz de medir a quantidade de luz absorvida por determinada amostra. O resultado deste método é um gráfico, conhecido de espectro, cujos valores permitiram-nos da aula anterior retirar que 595 nm é o comprimento de onda ótimo de absorvância da proteína BSA, sendo por isto, o comprimento de onda que vamos usar neste trabalho laboratorial.

Os componentes principais do espectrofometro são:

- Fonte de luz: o espectrofotómetro pode ser composto por uma ou duas lâmpadas que podem ser de deuretério emitindo radiação UV e a outra de tungsténio e emitirá luz visível.

- Monocromador: os aparelhos mais antigos podem possuir um prisma monocromador, mas os mais modernos possuem dispositivos que transformam a luz incidida em vários comprimentos de onda num só, a luz monocromática.

- Cuvete: recipiente que contém a amostra em análise que deverá de ser de quartzo quando houver a necessidade de trabalhar com UV.

- Detetor: dispositivo que deteta a fração de luz que passou pela cuvete e transfere esse valor para o ecrã do aparelho.

A espectrofotometria está fundamentalmente ligada à Lei de Lambert-Beer:

A= εcl, onde: A é a absorvância; ε é o coeficiente de extinção molar; l é o comprimento da cuvete.

Baseando-nos nesta lei, podemos concluir que a absorvância é diretamente proporcional à concentração da solução oque implica também que para uma solução mais concentrada haja maiores valores de absorvância e  de forma semelhante, quanto maior a distância também maior será a absorvância.

II. Resultados

	Branco	Padrão 1	Padrão 2	Padrão 3	Padrão 4
Concentração (µg/ µL)	0	0,01	0,02	0,04	0,07
Absorvância (A)	0	0,477	0,834	1,277	1,594

Dados:

Gráfico:[pic 3]

[pic 4]

Cálculo das concentrações:

[pic 5]

[pic 6]

Padrão 1

[pic 7]

[pic 8]

Padrão 2

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Padrão 3[pic 11]

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[pic 13]

Padrão 4

[pic 14]

[pic 15]

III. Discussão e considerações finais

O principal objetivo desta atividade laboratorial foi a construção de uma reta padrão para proteína BSA (Bovine serum albumin). Para a sua construção utilizámos vários métodos, mais especificamente o método de espectrofotometria e o método de Bradford (já falado no relatório anterior).

A espetrofotometria é uma técnica de análise química que estuda a interação entre a energia radiante e a matéria. Este método é qualitativo e também quantitativo, uma vez que permite a substância presente numa dada solução e também a quantidade desta. Este método baseia-se na absorção ou emissão de energia por parte da substância em estudo. Quando a radiação monocromática de determinado comprimento de onda atravessa uma solução, a energia emitida pela solução, vai ser menor do que aquela que incidiu sobre esta. A esta intensidade de radiação chamamos de absorvância, que é uma característica que esta diretamente relacionada com a natureza da amostra, a sua capacidade de absorver radiação assim como com a sua concentração na solução e a espessura do recipiente onde está contida (l). Estas relações são traduzidas pela lei de Lambert-Beer. Com base nesta lei, temos que: A = E I c, em que A é a absorvância, E é o coeficiente de extinção (constante característica de cada espécie química), I é o trajeto ótico da luz e, por fim, c é a concentração.

O coeficiente de extinção E, é uma característica de cada substância e depende também do solvente em que está dissolvido, da temperatura e do comprimento de onda utilizado. Devido a sua grande especificidade, por vezes, não é possível verificar os valores tablados para esta grandeza, o que impede de utilizar a lei de Lambert-Beer diretamente para obter a concentração da sustância. Por conseguinte recorremos a elaboração de uma reta-padrão, o objetivo desta atividade prática. Esta reta vai representar vai representar a lei de Lambert-Beer a partir dos valores de absorvância obtidos de soluções -padrão da proteína em estudo. O gráfico resultante terá no eixo das ordenadas os valores de Absorvância obtidos e no eixo das abcissas a concentração. O declive desta reta corresponde à constante de proporcionalidade.

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