TRABALHO DE BIOQUIMICA ELETROFORESE

UDC

MARCELO MUELLER

TRABALHO DE BIOQUIMICA

ELETROFORESE

FOZ DO IGUAÇU

2017

INTRODUÇÃO

 Eletroforese é um método para separar e analisar moléculas de uma determinada amostra de acordo com suas migrações em um campo elétrico.

O método foi desenvolvido em 1937 por um pesquisador sueco chamado Arne Tiselius para separar proteínas do plasma sanguíneo. De acordo com Rocha et al. (2005 p. 2)

A eletroforese é uma técnica de separação baseada na migração das moléculas carregadas, numa solução, em função da aplicação de um campo elétrico. A eletroforese de proteínas foi realizada pela primeira vez em 1937 por Arne Tiselius, que idealizou um método denominado eletroforese livre, o qual consistia na decomposição do soro sangüíneo em cinco frações protéicas principais, trabalho que lhe rendeu um prêmio Nobel.

Para Marzzoco e Torres (1999, p.35) essa técnica consiste em colocar uma amostra em uma superfície de papel ou gel, mergulhados em um recipiente contendo uma solução tampão e os eletrodos: um positivo e outro negativo. Esse sistema é submetido a uma corrente elétrica. As proteínas nesse instante começam a mover-se para os pólos de cargas opostas a suas. Devido a diferença de tamanho, algumas moléculas movimentam-se mais rapidamente e conseguem alcançar distâncias maiores e outras mais lentas percorrem distancias curtas. Terminado o processo, tem-se as moléculas separadas uma das outras, facilitando a análise delas.

MATERIAIS NECESSÁRIOS

Para que a eletroforese funcione são necessários três principais fatores: uma solução tampão, para manter as moléculas estáveis e também para facilitar a passagem da corrente elétrica, os polímeros que são o meio pelo qual as moléculas vão correr para os pólos opostos e os corantes que vão mostrar o posicionamento das moléculas após o fim do procedimento.

Os polímeros são compostos por macromoléculas constituídas pelas repetições de moléculas menores: monômeros. Para a eletroforese são utilizados dois tipos de polímeros: o gel de agarose e o gel de poliacrilamida. O gel de agarose é usado para a separação de moléculas maiores como o DNA e RNA. O gel de poliacrilamida é usado para separar moléculas menores, também usadas no DNA e RNA além das proteínas.

Quanto maior for a concentração do gel menor será a sua malha,  o que aumenta a qualidade da imagem do resultado.

TIPOS DE ELETROFORESE

Existem dois tipos de eletroforese: eletroforese desnaturante e eletroforese bidimensional.

Marzzoco e Torres (1999, p.35) explica que a eletroforese desnaturante  é a adição, no gel de poliacrilamida, de um detergente: dodecil sulfato de sódio (SDS) que, ligando-se aos radicais hidrofóbicos das proteínas, faz com que elas percam moléculas de água. É utilizada para analisar as massas moleculares de proteínas oligoméricas

A eletroforese bidimensional foi desenvolvida em 1975 por O’Farrel e Klose.

Uma das principais vantagens da eletroforese 2D é a capacidade de separar em alta resolução um grande número de proteínas de uma amostra e a possibilidade de fazer análise de expressão gênica por meio da comparação dos padrões genéticos. Ela trabalha ao mesmo tempo com o peso e o ph da proteína.

Porém para Rocha et al. (2005 p.4) não é possível visualizar em um único gel todas as proteínas. Proteínas com peso molecular muito alto ou muito baixo não são bem separados, assim como as moléculas hidrofóbicas ou alcalinas que precisam de métodos específicos.”

A principal diferença entre a eletroforese desnaturante e a eletroforese bidimensional é que a primeira além de fazer com que haja perda de uma molécula de água, a utilização dela é para a análise da massa das moléculas. Com o segundo método consegue-se separar as moléculas ao mesmo tempo tanto pela sua massa quanto pelo valor de ph.

UTILIZAÇÕES

Os testes de eletroforese são empregados em exames para a identificação de doenças e separação de matérias genéticos como DNA e RNA, como: PCR, Western Blot e Cromatografia por exemplo.

O exame de PCR ( Reação em cadeia da Polimerase), amplia uma sequência única de DNA em milhões de vezes. Com isso possibilita identificação de algumas doenças infecciosas e genéticas, comprovação da paternidade e determinação de linhagem em animais.

A técnica Western Blot é usada para detectar proteínas em tecidos biológicos. De acordo com Nunes (2017) “A técnica de western blotting (Towbin et al. 1979; Burnette 1981; Towbin and Gordon 1984) também pode ser denominada protein immunoblot e consiste na detecção de proteínas específicas em amostras de lisados celulares ou de tecidos.”

Essa técnica é usada principalmente no teste de HIV.

MODO DE PREPARO DA ELETROFORESE

Para exemplificar o preparo de uma eletroforese sera usado o modelo de eletroforese bidimensional. De acordo com Bezerra Junior (2013) São cinco passos que devem ser seguidos: 1-preparação da amostra, 2- separação do ponto isoelétrico, 3- separação por tamanho, 4-detecção das proteínas e 5- digitalização e análise de imagem.

1-Preparo da amostra: é a fase onde será “limpa” a proteína, desligando elas de outras moléculas não proteicas

2- separação do ponto isoelétrico: processo onde as proteinas começam a se separar de acordo com o seu valor de ph.

3- separação por tamanho: Segundo processo onde as moleculas são separadas de acordo com sua massa e tamanho.

4- detecção de proteinas: processo onde já é possivel ver as proteínas separadas no gel.

5- digitalização e análise de imagem: processo onde os geis, contendo as proteínas, são colocados em um scanner que mostrará todas as moléculas divididas de acordo com o ph e a massa.

FIGURAS DEMONSTRATIVAS