Bioquimica experimental - fracionamento celular

Relatório 1

        O Relatório 1 consiste no tratamento de dados e análise dos resultados obtidos nas práticas 1 a 3, sendo elas: fracionamento celular; dosagem de proteína e determinação da atividade enzimática; executadas durante o mês de Agosto do decorrente ano, 2010 na disciplina QBQ0316 – Bioquímica Experimental. Tais procedimentos tiveram como intuito a análise das propriedades das proteínas por meio da execução de métodos empíricos de purificação de proteínas e análises qualitativas e quantitativas.

        

        Após ser feita o fracionamento celular de cerca de 1g de levedura dado para cada grupo no laboratório, que servirá de modelo experimental (Saccharomyces cerevisae) para as demais práticas, teve-se como principal interesse a extração, purificação e caracterização; portanto, o estudo da enzima α-glicosidase (maltase).

        Primeiramente, para se realizar a dosagem de proteínas utilizou-se o método da espectrofotometria, de modo a detectar e quantificar as moléculas por meio da sua absorção de luz, já observada na Lei de Bouger-Lambert-Beer:

Log I/Io = -ε.c.l = -1(absorbância) = 1/transmitância

sendo, ε = coeficiente de absorção molar característico da molécula

c = concentração

l = caminho percorrido pela luz (caminho ótico)

I = luz “recuperada”

Io = luz incidente

        Logo, por meio do corante de Bradford (Comassie brilliant blue G), que forma complexos com proteínas de modo a alterar o seu máximo de absorção de 465nm para 595nm, na prática 2 (procedimento A        ), construiu-se uma curva padrão com uma solução de albumina (0,2g/L), a partir das massas distintas de proteínas e absorbâncias a 595nm observadas no espectrofotômetro.

Tabela para montagem da curva-padrão da proteína

(a partir dos resultados tidos no Procedimento A da Prática 2)

Tubos	Massa de proteína (mg)	Absorbância 595
1	0,002	0,0721
2	0,004	0,02505
3	0,006	0,3814
4	0,008	0,4117
5	0,010	0,5426
6	0,012	0,6263
7	0,014	0,7428
8	0,016	0,8370

[pic 1][pic 2]

[pic 3]

Gráfico 1: Curva Padrão para a quantificação de Proteínas com o reagente de Bradford pelo tempo de reação

Como já esperado pela equação A = ε.c.l = k.c, sendo A= absorbância; ε = coeficiente de absorção molar; l = caminho percorrido pela luz (caminho ótico); k = constante; e válida a aproximação de que A= (inclinação da reta da curva-padrão) x (massa), observa-se na curva padrão, o crescimento da reta, ou seja, quanto maior a massa de proteína, maior fora observada a sua absorbância. Teoricamente, quando a massa de proteína fosse equivalente a zero, a absorbância também deveria ser nula; no entanto, devido a influências do meio, imperfeição dos procedimentos experimentais, a variação de 0,018 tida no intercepto no eixo y é justificável.

No procedimento B da mesma prática, teve-se a finalidade de dosar as proteínas no lisado de Saccharomyces cerevisae utilizando diferentes volumes deste a uma mesma diluição 100X (0,1mL do lisado + 9,9 mL de água destilada). A montagem da tabela a seguir foi feita utilizando-se a equação obtida no procedimento A, para quantificar a massa de proteína encontrada no lisado.

Tabela para o cálculo da concentração de proteínas no lisado do Saccharomyces cerevisae

(a partir dos resultados tidos no Procedimento B da Prática 2)

Tubos	A595	Massa de proteína (mg)	Volume da amostra (ml)	Concentração (mg/ml)	Diluição prévia (x)	Concentração do lisado original(sem diluição) (mg/ml)
A1	0,4038	0,00746	0,10	7,46.10	-	0,0746
A2	0,2943	0,00534	0,05	5,34.10	100	0,1068
A3	0,0952	0,00149	0,03	1,49.10	100	0,0496
A4	0,0824	0,00124	0,02	1,24.10	100	0,0620

        

Média das Concentrações do lisado original (sem diluição) =  0,0732 mg/mL

Média das Concentrações com diluição = 3,88 mg/mL

Já na prática 3 para determinar a atividade da enzima α-glicosidase presente no lisado, mediu-se as absorbâncias após diferentes tempos de reação e em diferentes diluições. O cálculo do número de mols de produto formado foi realizado a partir da curva-padrão de p-nitrofenolato (página 7 da apostila de Bioquímica experimental), cuja equação da reta é dada por: