Relatório de aula prática: Doseamento de Proteínas - Reativo de Biureto

Centro Universitário Hermínio Ometto|Uniararas

Curso de Farmácia - Disciplina de Bioquímica Básica

Orientado pelo Prof. Acácio Antonio Pigoso

Relatório de aula prática:

Doseamento de Proteínas - Reativo de Biureto

Julia Helena Bertini RA: 93324

Maria Fernanda Morales RA: 100544

Mirella Rodrigues RA: 99873

Rafaela Cristina Bueno RA: 99685

Araras, abril/2018

Introdução

A ligação entre um grupo carboxila de um aminoácido com o grupo amina de outro, por uma ligação covalente é o que chamamos de ligação peptídica, uma relação necessária para a formação de uma cadeia que contem informações necessárias e que resultam em proteínas totais. O reativo de Biureto é um dos métodos mais utilizados na identificação e quantificação de proteínas, pois seu meio alcalino, reage com a proteína da ligação peptídica resultando em um produto corado, e medido por espectrofotometria. Sua avaliação é importante para o diagnostico clínico de diversas enfermidades, uma vez que, proteínas possuem funções de atuação como enzimas, hormônios, neurotransmissores, transportadores de membranas, entre outros. Sua análise tem sua importância também nas análises clínicas, facilitando o diagnostico de doenças relacionadas com a quantidade de proteínas nos fluídos biológicos, como a desnutrição, obesidade, anorexia, entre outros. (Zaia, et al. 1998)

O princípio do método para identificar proteínas através da reação utilizando Biureto gerou muita discussão desde 1915, quando descoberto por Autenrieth, desde então vários autores tentaram modificar o método, mas o que se mantem até hoje é constituído por uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza a reação do cobre, em meio alcalino, que reage com proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica. O produto de reação apresenta duas bandas de absorção, que por serem formadas por aminoácidos e considerando-se que os aminoácidos aromáticos absorvem luz na região ultravioleta, as proteínas, em geral, podem ser detectadas através da absorção de luz a 270 nm. No entanto, a detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações específicas com determinados reativos, os quais originam substâncias coloridas que absorvem luz na região visível, permitindo a sua quantificação, como no caso das proteínas glicina, tirosina, ovo albumina, entre outras.

A espectrofotometria baseia-se no estudo do contato da luz com a matéria, e faz a medição da intensidade das radiações emitidas ou absorvidas pela amostra. Pode ser utilizada para identificar e quantificar substâncias químicas e medir a absorção da luz emitida na amostra analisadas. A espectrofotometria é um método analítico utilizado em diversas áreas como química, bioquímica, biologia, física, engenharia química e aplicações clínicas e industriais.

A Lei de Lambert-Beer estabelece uma relação entre a absorbância de uma solução e a sua concentração, quando a mesma é atravessada por uma radiação luminosa monocromática, sendo ela a principal base das técnicas espectroscópicas de absorção. Johannn Lambert e Wilhelm Beer propuseram que em um determinado comprimento de onda, a absorbância de uma amostra depende da quantidade de espécie absorvente que a luz encontra ao passar através de uma solução, logo, a absorbância depende tanto da concentração da amostra quanto do comprimento do caminho da luz pela amostra. A absorção de compostos orgânicos e inorgânicos esta relacionada com uma deficiência de elétrons na molécula, por exemplo, nos inorgânicos, o comprimento de onda de absorção depende de diversos fatores, como o tipo de metal envolvido, do número de grupos coordenados, da basicidade, entre outros. Já em compostos orgânicos, os que possuem dupla ligação absorvem fortemente no ultravioleta.

Objetivos

• Compreender a importância clinica e biotecnológica de se dosear proteínas;
• Identificar e caracterizar a presença de proteínas (Albumina) e aminoácidos em material biológico através da reação do biureto;
• Conhecer e compreender os princípios e como se aplica a espectrofotometria no experimento;
• Realizar o cálculo da equação da reta e compreender suas etapas;

Metodologia

Para o procedimento foram utilizados os seguintes materiais: 7 tubos de ensaio; 3 substancias distintas; leite; suco de fruta; 1 amostra desconhecida de soro/plasma; o reativo de Biureto, água destilada pipetas graduadas, pera de sucção e espectrofotômetro.

No primeiro tubo foi adicionado com o auxilio de pipetas graduadas 500 ul de glicina 0,25%; no segundo tubo foi adicionado 500 ul de tirosina 0,25%; no terceiro tubo adicionado 500 ul de ovoalbumina 1%; no quarto tubo adicionado 500 ul de leite; no quinto tubo adicionado 500 ul de suco de limão no sexto tubo adicionado água destilada para o nosso ‘’branco’’, e no sétimo tubo adicionado 500 ul de amostra desconhecida.

Após essa adição das substâncias, água e amostra desconhecida nos tubos, foram acrescentados mais 1 ml de Biureto em cada um dos tubos, homogeneizamos as soluções e observamos as reações que ocorreram, teste esse denominado qualitativo.

Após isso, utilizamos os mesmo tubos para quantificar a absorbância de cada substância no espectrofotômetro com comprimento de onda em 540 nm, para observar os picos de absorção das substâncias analisadas.

Primeiro, alteramos o comprimento de onda do espectrofotômetro, em seguida, em uma cubeta com água destilada zeramos o equipamento para assim colocar a cubeta com as respectivas substâncias. Após zerarmos uma vez o espectrofotômetro não foi necessário zerar outra vez já que o comprimento de onda seria o mesmo para os 7 tubos analisados.

[pic 2]

Fígura 1:  Os 7 tubos após a adição das substâncias; água destilada e amostra desconhecida já com o reativo de Biureto, após homogeneização

[pic 3]

Figura 2: tubo um com glicina 0,25% + biureto; tubo dois com tirosina 0,25% + biureto; tubo três com ovoalbumina 1% + biureto após homogeneização evidenciando para um teste qualitativo a ausência de proteína pela coloração azulada e não arroxeada.

[pic 4]

Figura 3: tubo quatro com água destilada; tubo cinco com leite; tubo seis com suco de frutas e tubo sete com amostra desconhecida, evidenciando positivo para presença de proteínas, exceto a água destilada no tubo quatro.