Analise Comparativa Entre Neutrófilos Em Repouso E Ativados Por PAF + FMLP

INTRODUÇÃO

Atualmente, pessoas que sofrem um acidente, e chegam a um quadro clínico de falência múltipla de órgãos (MOF), possuem cerca de 50% de chances de vir a óbito. Isto ocorre porque o tratamento atual, basicamente, envolve o monitoramento e o prolongamento do tempo de vida do órgão afetado. Este tratamento é auxiliado principalmente por aparelhos externos e por drogas vasoativas. Tudo na tentativa de fazer com o que o paciente possua mais tempo para reverter a recorrente situação clínica desfavorável. Estão sendo testados outros tratamentos que tiveram algum sucesso como: o uso de proteína C ativada, esteroides em pequenas doses e tratamentos com insulina. Porém, a eficácia destes tratamentos é ainda insatisfatória (~10% de melhora). Por estas razões, desvendar os mistérios que sondam a falência múltipla de órgãos tem sido um dos principais desafios das pesquisas na área de saúde (FONTES, W, 2009) (WERSCHE, D. E, et al., 2005).

Sabe-se que o neutrófilo é um fator frequentemente associado a este processo. Estas células são, de longe, as mais abundantes dentre os nossos leucócitos circulantes (40-70%). Possuem importância primordial nas respostas imune e inflamatória. Dentre suas funções destacam-se: fagocitose, secreção/utilização de grânulos de diversos tipos; secreção de citocinas; participação efetiva em processos inflamatórios; ação rápida na eliminação de patógenos como bactérias, fungos e protozoários; formação de NETs (Neutrophil extracellular Traps) que são espécies de armadilhas compostas por DNA, histonas e proteínas granulares capazes de “prender” e matar bactérias nos tecidos; auxílio na formação de complexos proteicos como o sistema complemento, e por aí vai. Um quadro de isquemia e reperfusão intestinal, por exemplo, comum em casos de hipovolemia sanguínea, pode contribuir para a promoção de uma disfunção ou uma hiperatividade desta célula. Com isso, o neutrófilo passa a promover uma ampliação do dano tecidual. E não para por aí, podemos observar disfunção celular ocasionada também por trauma grave, casos de infecção/sepse, pós-trauma, SIRS, ARDS, e até mesmo em casos de transfusão sanguínea (BOTHA, A. J; et al, 1995) (JUNICHI, A; et al, 2001) (PARTRICK, D. A; et al, 1996) (VEDDER, N. B; et al, 1989) (CASSATELA, M. A, 2003) (TELEZ, L. M. B, 2007) (BRINKMANN, V; ZYCHLINSKY, A, 2007).

Para executar a quase totalidade destas funções é necessário que a célula esteja estimulada/ativada. Por esta razão, comparamos a expressão proteica da célula em repouso com a expressão relativa à célula ativada. Neste trabalho utilizamos o PAF (platelet activating factor), um agente inflamatório de grande importância e presença em pacientes com trauma / ferimentos diversos. Este estimulador compreende uma família de estruturas que participam de diversos eventos, tais como adesão, sinais intra e intercelulares, apoptose, homeostase cardiovascular, alergia, injúria do tecido pulmonar, rejeição a transplante de órgãos, choque séptico e síndrome da resposta inflamatória, dentre outros. Além disso, este estímulo resulta em uma baixa liberação de ROS, por este motivo entende-se que ocorra um estímulo de menor grau quando comparado a ativadores como fMLP e PMA (NASCIMENTO, E, 2008) (MCMANUS, L. M; PINCKARD, R. N, 2000) (RODRIGUEZ, C. G, 1993) (ROCHA, A. V, 2004) (BOTHA, A. J; et al., 1995).

Já o fMLP (Formyl – Methionyl – Leucyl - Phenylalanine) representa peptídeos que derivam de degradação proteica bacteriana ou de proteínas mitocondriais perante dano tecidual. Sua estimulação esta associada a eventos tais como remodelamento de actina, aderência, influxo de cálcio, quimiotaxia, produção de ROS, liberação de grânulos e enzimas granulares, e por aí vai. Muitos destes efeitos são comuns para ambos os estimuladores, mas existem especificidades tanto nas vias ativadas quanto nas respostas geradas. O uso consecutivo destes estimuladores em contato com os neutrófilos objetivou uma simulação do que seria um quadro de trauma/infecção (COPE ADVERTISING OPTIONS, 2010) (SELVATICI, R; et al, 2006) (NICK, J. A; et al, 1997).

Portanto, a fim de prover dados que venham a contribuir para a elucidação desta disfunção, foi proposta a elaboração de mapas proteômicos de neutrófilos comparando-se diferentes estágios de ativação desta célula. A grande finalidade desta estratégia é encontrar possíveis alvos, visando à modulação desta disfunção no intuito de reduzir o dano tecidual causado, sem interferir nas importantes funções imuno-inflamatórias desempenhadas por esta célula.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Separação de Neutrófilos

Para a separação dos neutrófilos foi utilizado um método já otimizado, através da montagem de diferentes gradientes de densidade obtidos com percoll, HBSS 10X e HBSS 1X. No procedimento, realizou-se a montagem dos gradientes. Após isso, realizou-se a coleta de sangue e sua devida deposição nos tubos (já com os gradientes preparados). Depois foi realizada uma centrifugação onde um alo de granulócitos pôde ser observado, em cada tubo, e isolado em novos tubos, que então foram preenchidos com ~5mL de HBSS 1X para que se mantivesse o equilíbrio osmótico das células. Em seguida, foram realizadas algumas lavagens e observaram-se pellets ainda contendo pequena quantidade de hemácias. Neste ponto foi feita a hemólise hipotônica. Ao final da hemólise obtivemos um pellet branco-amarelado contendo os granulócitos com 99% de pureza, analisada na contagem utilizando-se microscopia óptica, câmara de neubauer, solução de Turk e uma fórmula matemática apropriada (2,5 x 6 x (A+B+C+D) = número de células / µL (UYESAKA, A. T; ARAI, K, 1989).

2.2. Ativação Celular

Após a obtenção dos neutrófilos foi realizada a ativação das células utilizando o PAF (200 nM) e, após 5 min, o fMLP (1mM) e foram mantidas incubadas a 37oC em banho maria (30 min). As concentrações e o tempo foram selecionados baseados na literatura.

2.3. Extração de Proteínas

A amostra contendo neutrófilos em suspensão ativados foi centrifugada a 1500rpm por 5min. Após isso, descartou-se o sobrenadante e acrescentou-se 445 microlitros do tampão de lise (pH 4-7) (Uréia 7M, Tioréia 2M, Triton-X 100 1%, Amberlyte 1%, Pharmalyte (4 a 7)) ao pellet obtido. Depois foi feito um vortex por 5min. Por fim, incubou-se por 1h a 750 rpms a 25 graus Celsius.

2.4. Eletroforese Bidimensional

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