Reação De Precipitação

INTRODUÇÃO

2.1 O que são proteínas

As proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes e importantes nas células e perfazem 50% ou mais de seu peso seco. São encontradas em todas as partes de todas as células, uma vez que são fundamentais sob todos os aspectos da estrutura e função celulares. Existem muitas espécies diferentes de proteínas, cada uma especializada para uma função biológica diversa. Além disso, a maior parte da informação genética é expressa pelas proteínas.

Pertencem à classe dos peptídeos, pois são formadas por aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas. Uma ligação peptídica é a união do grupo amino (-NH 2 ) de um aminoácido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminoácido, através da formação de uma amida.

São os constituintes básicos da vida: tanto que seu nome deriva da palavra grega "proteios", que significa "em primeiro lugar". Nos animais, as proteínas correspondem a cerca de 80% do peso dos músculos desidratados, cerca de 70% da pele e 90% do sangue seco. Mesmo nos vegetais as proteínas estão presentes.

A importância das proteínas, entretanto, está relacionada com suas funções no organismo, e não com sua quantidade. Todas as enzimas conhecidas, por exemplo, são proteínas; muitas vezes, as enzimas existem em porções muito pequenas. Mesmo assim, estas substâncias catalisam todas as reações metabólicas e capacitam aos organismos a construção de outras moléculas - proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos e lipídios - que são necessárias para a vida.

Todas contêm carbono, hidrogênio, nitrogênio e oxigênio, e quase todas contêm enxofre. Algumas proteínas contêm elementos adicionais, particularmente fósforo, ferro, zinco e cobre. Seu peso molecular é extremamente elevado.

Todas as proteínas, independentemente de sua função ou espécie de origem, são construídas a partir de um conjunto básico de vinte aminoácidos, arranjados em várias seqüências específicas.

2.2 Estruturas

As proteínas podem ter 4 tipos de estrutura dependendo do tipo de aminoácidos que possui, do tamanho da cadeia e da configuração espacial da cadeia polipeptídica. As estruturas são:

2.2.1 Estrutura primária É dada pela seqüência de aminoácidos ao longo da cadeia polipeptídica. É o nível estrutural mais simples e mais importante, pois dele deriva todo o arranjo espacial da molécula. São específicas para cada proteína, sendo, geralmente, determinadas geneticamente. A estrutura primária da proteína resulta em uma longa cadeia de aminoácidos, com uma extremidade "amino terminal" e uma extremidade "carboxi terminal". Sua estrutura é somente a seqüência dos aminoácidos, sem se preocupar com a orientação espacial da molécula. Suas ligações são ligações peptídicas e pontes dissulfeto.

Representada pela sequência de aminoácidos unidos por meio das ligações peptídicas. É ligada a carboidratos assim como outro.

2.2.2 Estrutura secundária

É dada pelo arranjo espacial de aminoácidos próximos entre si na sequência primária da proteína. É o último nível de organização das proteínas fibrosas, mais simples estruturalmente.

Ocorre graças à possibilidade de rotação das ligações entre os carbonos alfa dos aminoácidos e os seus grupos amina e carboxilo. O arranjo secundário de uma cadeia polipeptídica pode ocorrer de forma regular; isso acontece quando os ângulos das ligações entre carbonos alfa e seus ligantes são iguais e se repetem ao longo de um segmento da molécula.

São dois os tipos principais de arranjo secundário regular:

• alfa-hélice: presente na estrutura secundária dos níveis de organização das proteínas. São estruturas cilindricas estabilizadas por pontes de hidrogénio entre aminoácidos. As cadeias laterais dos aminoácidos encontram-se viradas para fora. Existem várias formas de como as hélice alfa podem organizar-se.

• folha-beta: padrão estrutural encontrado em várias proteínas, nas quais regiões vizinhas da cadeia polipeptídica associam-se por meio de ligações de hidrogénio, resultando em uma estrutura achatada e rígida

2.2.3 Estrutura terciária

Resulta do enrolamento da hélice ou da folha pregueada, sendo estabilizada por pontes de hidrogênio e pontes dissulfeto. Esta estrutura confere a atividade biológica às proteínas.

A estrutura terciária descreve o dobramento final de uma cadeia, por interações de regiões com estrutura regular ou de regiões sem estrutura definida, podendo haver interações de segmentos distantes de estrutura primária, por ligações não covalentes.

Enquanto a estrutura secundária é determinada pelo relacionamento estrutural de curta distância, a terciária é caracterizada pelas interações de longa distância entre aminoácidos, denominadas interações hidrofóbicas, pelas interações eletrostáticas, pontes de hidrogenio e de sulfeto. Todas têm seqüências de aminoácidos diferentes, refletindo estruturas e funções diferentes. Efetua interações locais entre os aminoácidos que ficam próximos uns dos outros.

2.2.4 Estrutura quaternária

Algumas proteínas podem ter duas ou mais cadeias polipeptídicas. Essa transformação das proteínas em estruturas tridimensionais é a estrutura quaternária, que são guiadas e estabilizadas pelas mesmas interações da terciária.A junção de cadeias polipeptídicas pode produzir diferentes funções para os compostos.

Um dos principais exemplos de estrutura quaternária é a hemoglobina. Sua estrutura é formada por quatro cadeias polipeptídicas.

Figura 1 - Estrutura da Hemoglobina

2.3 Reação da Ninhidrina

A reação da Ninhidrina é de extrema importância na Bioquímica e é utilizada na detecção de aminoácidos por ter a característica amina primária. Por ser um agente oxidante muito poderoso, a ninhidrina reage com o aminoácido da cadeia, dando origem a um composto de cor púrpura.

2.4 Reação do Biureto

O reagente de biureto é um reagente analítico feito de hidróxido de potássio (KOH) e sulfato de cobre (II) (CuSO4), junto com tartarato de sódio e potássio (KNaC4H4O6•4H2O). Este reagente de coloração azul torna-se violeta na presença de proteínas, e muda para rosa quando combinado com polipeptídeos de cadeia curta. O esquema abaixo representa um modelo da formação desse complexo:

Figura 2 - Estrutura do complexo

2.5 Precipitação de proteínas com desnaturação

A temperatura é um fator importante na solubilização das proteínas. Em geral, entre O e 40°C o aumento da temperatura favorece a solubilidade. Isto decorre do fato do calor provocar um aumento da energia cinética das moléculas de proteína, facilitando a interação destas com o solvente. Entretanto, acima de 40°C, as proteínas começam a precipitar: os movimentos moleculares se tornam tão intensos que os grupamentos químicos se afastam além da distância permitida para se reassociarem, aproximando-se de outros com os quais se associam. Assim, ocorre o rompimento das estruturas secundária, terciária e quaternária e a proteína adquire outra conformação, uma conformação inativa (desnaturada).

2.6 Precipitação por reação com os reagentes para alcalóides

Os ânions de alcalóides (TCA) são capazes de se combinar com proteínas que possuam resíduos de aminoácidos na forma de cátions, formando complexos insolúveis que se precipitam e caracterizam a desnaturação.

2.7 Precipitação por reação com metais pesados

Os cátions de metais pesados como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+ formam precipitados insolúveis de proteínas, denominados de acordo com o elemento formador (exemplo: proteinato de mercúrio, proteinato de chumbo, etc.). Essa precipitação é mais intensa quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI). Isso porque, acima do pI, a carga líquida sobre a proteína é negativa (ver determinação do ponto isoelétrico da caseína), favorecendo a interação com os cátions provenientes do sal.

2.8 Precipitação por reação com solventes orgânicos

A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em água. Isso acontece porque a capacidade de interação com as partículas de soluto é diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de interação do solvente com o soluto é denominada constante dielétrica. A água apresenta constante dielétrica bastante elevada

A precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura.

Os solventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante úteis na separação de misturas de proteínas. A temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar à desnaturação por rompimento das pontes de hidrogênio e estabelecimento de interações apolares, importantes na manutenção da conformação protéica.

2.9 Efeito da força iônica sobre a solubidade

Em baixas concentrações de sais (baixa força iônica), a solubilidade em geral aumenta, pois os íons salinos tendem a se associar às proteínas contribuindo para uma hidratação e/ou repulsão entre as moléculas, aumentando a solubilidade “salting in”.

2.10 Reações de precipitação sem desnaturação

A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das proteínas é uma função de sua força iônica, que tanto depende de sua concentração como da valência de cátions e ânions que formam o sal. Em altas forças iônicas, conseguidas pela adição de grandes quantidades de um sal muito solúvel (por exemplo, o sulfato de amônio) a uma solução de proteína, pode ocorrer remoção de moléculas de água de hidratação das proteínas, o que leva à predominância das interações proteína-proteína, resultando em precipitação, fenômeno conhecido como salting-out

3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

3.1 Materiais a serem utilizados nos procedimentos a seguir

• 10 Tubos de ensaio

• 01 Béquer de 50 mL

• 04 pipetas graduadas de 5 mL

• 04 pipetas graduadas de 2 mL

• 01 pipeta graduada de 10 mL

• 01 bastão de vidro

• Estante para tubos de ensaio

• Prendedor de tubos de ensaio (para aquecimento)

• Pipetas de Pasteur

• Peras

• Bico de Bunsen

• Caneta hidrográfica

• Pisseta com água destilada

3.2 Reações de coloração de proteínas

3.2.1 Reação com ninhidrina

Reagentes:

• Solução de ninhidrina a 0,1% em tampão fosfato pH 7,0 (10mM)

• Solução de proteínas: clara de ovo a 10% v/v e, solução salina 0,9%

• Solução de glicina 0,1%

Procedimento:

• Numerou-se 02 tubos de ensaio em que no primeiro adicionou-se 2 mL da solução de ninhidrina e 5 gotas de proteínas e aqueceu em chama direta durante aproximadamente 2 minutos. Observou-se o aparecimento de coloração;

• No segundo tubo de ensaio colocou-se 2 mL da solução de ninhidrina com 5 gotas de glicina e ferveu em chama direta durante aproximadamente 2 minutos. Observou aparecimento de coloração.

3.2.2 Reação do biureto

Reagentes:

• Solução de hidróxido de sódio 2,5 M

• Solução de sulfato de cobre 1%

• Solução de proteína: clara de ovo a 10% v/v em solução salina 0,9%

• Solução de glicina 0,1%

Procedimento:

Numerou-se 03 tubos de ensaio e colocou-se no primeiro tubo, 1 mL da solução de proteínas com 5 gotas de NaOH 2,5 M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Observou-se se houve aparecimento de coloração;

No segundo tubo adicionou-se 1 mL de solução de glicina com 5 gotas de e NaOH 2,5 M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Observou-se o aparecimento de cor e comparou-se esta com a do tubo 03;

No terceiro tubo colocou-se 1 mL de água estilada juntamente com 5 gotas de com 5 gotas de NaOH 2,5 M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Observou-se o aparecimento de coloração e comparou-se esta com o tubo 02. Este tubo corresponde ao branco.

3.3 Reações de precipitação de proteínas

3.3.1 Reações de precipitação com desnaturação

Reagentes:

• Solução de proteínas preparada pela diluição de clara de ovo a 10% v/v com solução salina (NaCl 0,9g% (p/v))

• Ácido

tricloroacético (TCA) a 10% (p/v)

• Álcool etílico absoluto

- Precipitação por ação do calor

Procedimento:

Em um tubo de ensaio colocou-se 2 mL da solução de proteínas e este tubo foi aquecido diretamente na chama e observou-se.

- Precipitação por reação com reagentes para alcalóides

Procedimento:

Em um tubo de ensaio colocou-se 1 mL da solução de proteínas e 1 mL de ácido tricloroacético (TCA) e observou-se.

- Precipitação com metais pesados

Procedimento:

Em um tubo de ensaio colocou-se 1 mL da solução de proteínas e 1 mL de acetato de chumbo a 5% e observou-se o ocorrido.

- Precipitação por ação de solventes orgânicos

Procedimento:

Em um tubo de ensaio colocou-se 1 mL da solução de proteínas e de 1 a 3 volumes (até o aparecimento de precipitado) de álcool etílico e observou-se.

3.3.2 Reações de precipitação sem desnaturação

(efeito força iônica sobre a solubilidade das proteínas)

Reagentes:

• Clara de ovo “in natura”

• Cloreto de sódio 1 M

• Solução saturada de sulfato de amônio 76,6 g% (p/v)

- Solubilização (“salting in”)

Procedimento:

Colocou-se em um béquer 3 mL de clara de ovo e diluiu-se este com um pequeno volume de água destilada, sob agitação suave com o bastão de vidro até o aparecimento de precipitado. Após foi adicionado gota a gota a solução de NaCl até a redissolução deste precipitado.

- Precipitação

Procedimento:

Pipetou-se 2 mL da solução do procedimento anterior (“salting in”) em um tubo de ensaio.Foi adicionado 2 mL de solução saturada de sulfato de amônio e observou a formação de um precipitado. Após colocou-se de 6 mL de água destilada até a redissolução deste precipitado.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES

1.1 – Reações de coloração de proteínas

1.1.1 – Reação com ninhidrina

Tabela 01 – Dados experimentais reação com ninhidrina.

Tubos Evidências

01 Logo no inicio do aquecimento observou-se a mudança de coloração da solução que antes era incolor e tornou-se violeta opaco (tom claro)

02 Observou-se a mudança de coloração da solução que antes era incolor e tornou-se violeta opaco (tom escuro, quase azul)

1.1.2 – Reação do biureto

Tabela 02 – Dados experimentais reação com biureto

Tubos Evidências

01 Observou-se a mudança de coloração: de incolor para violeta transparente. Portanto, a resposta é positiva para a reação – precipitação de proteínas

02 Observou-se a mudança de coloração: de incolor para azul opaco (tom claro)

03 BRANCO. Observou-se novamente a mudança de coloração: de incolor para azul opaco (tom claro)

Comparação das reações do tubo 2 com o 3:

O tubo 03 é o branco, ou seja, o teste com os reativos necessários para precipitação de proteínas, mas sem as proteínas presentes, apenas para comparar caso os testes sejam positivos (precipitação de proteínas – cor violeta) ou negativos (não precipitação de proteínas –cor azul).

O tubo 02 apresentou a mesma coloração do branco, entretanto o sistema do tubo 02 continha 1 mL de glicina que é o aminoácido mais simples que existe e portanto ele tem grupamentos amina disponíveis para reação.

Figura 3 - Estrutura da Glicina

1.2 – Reações de precipitação de proteínas

1.2.1 – Reações de precipitação com desnaturação

Tabela 03 – Dados experimentais das reações de precipitação com desnaturação

Reações – precipitação Evidencias

Ação do calor Com pouco aquecimento já se observou a formação do coagulo de coloração branca leitosa

Reagentes para alcalóides No momento da adição já se observou a formação do precipitado de coloração branca

Sais de metais pesados Observou-se a formação do precipitado na forma de pequenos fios, mas a solução continuou com cor inicial

Solventes orgânicos Com a adição de 1 mL já foi possível observar a formação do precipitado de cor branca (aspecto leitoso)

1.2.2 – Reações de precipitação sem desnaturação

(efeito força iônica sobre a solubilidade das proteínas)

Tabela 04 – Dados experimentais das reações de precipitação sem desnaturação

Reações Evidencias

Solubilização (“salting in”) Com aproximada mente 10 gotas de água, já foi possível observar pequenos fios brancos na clara do ovo – precipitado. Com a adição de um volume muito maior que o de água, de NaCl foi possível a redissolução do precipitado anteriormente formado.

Precipitação