Relatório De Aula Pratica: Identificação Bioquimica De Enterobacterias

As enterobactérias são uma família de bacilos Gram-negativos, com muitas propriedades em comum. Possuem motilidade variável, oxidase negativos, não esporulados, e que crescem em meios básicos (caldo peptona), meios ricos (ágar sangue, ágar chocolate e CLED), meios seletivos (Mac Conkey, EMB). São anaeróbios facultativos (crescem em aerobiose e anaerobiose), fermentam a glicose com ou sem produção de gás, são catalase positivos, e reduzem nitrato a nitrito. Embora possam ser encontradas amplamente na natureza, a maioria habita os intestinos do homem e dos animais, seja como membros da microbiota normal ou como agentes de infecção.

Para a identificação das Enterobactérias é observado primeiramente o crescimento destas bactérias em placas. O exame macroscópico da cultura permite uma análise do tamanho, aspecto morfológico e coloração da colônia. Estas observações consistem em analisar o tamanho (diâmetro) das colônias, tipo de bordas, elevações, cor, odor, densidade e consistência (MATERIAL CEDIDO EM AULA NO DIA 10 DE MARÇO, 2014). A diferenciação dos gêneros e espécies é realizada por meio de uma série de provas bioquímicas. Algumas espécies, em um mesmo gênero, são muito semelhantes, sendo necessário grande número de provas para diferenciá-las (REFERÊNCIA DE LIVRO).

A série bioquímica é composta de doze provas analíticas, das quais algumas podem ser feitas em conjunto num único tubo de ensaio, e outras devem ser feitas separadamente. Essas provas verificam basicamente a presença de determinadas enzimas, emissão de gás e motilidade. A partir da comparação dos resultados de todas as provas, verifica-se o gênero bacteriano analisado. O meio IAL/Rugai foi laborado para triagem de enterobactérias e consiste de nove provas em apenas um tubo de ensaio: indol (tampa), fermentação da sacarose, fermentação da glicose, produção de gás, fenilalanina, uréia, H2S, lisina e motilidade (ANVISA, 2007).

Na tampa do meio Rugai, é realizado o teste do Indol. O objetivo deste teste é determinar a capacidade do microrganismo degradar o aminoácido triptofano (presente em quase todas as proteínas) até indol. O triptofano é um aminoácido essencial que pode sofrer oxidação pelas atividades enzimáticas de algumas bactérias. A conversão do triptofano em produtos metabólicos é mediada pela enzima triptofanase (LABCLIN, 2009).

A capacidade de hidrolisar o triptofano com produção de indol (não é utilizado e acumula-se no meio) não é uma característica de todos os microrganismos, por isso serve como marcador bioquímico. Há microrganismos que não metabolizam o triptofano ou então fazem metabolização completa desse aminoácido sem produzir indol. As culturas que produzem um anel avermelhado na superfície do meio após adição do reagente são indol positivo. A persistência da coloração amarela do reagente demonstra que o substrato triptofano não foi hidrolisado a indol e indica uma reacção negativa (ANVISA, 2004).

Logo abaixo da prova de Indol temos as provas de fermentação da sacarose e glicose. A fermentação é um processo metabólico de óxido-redução produzido em ambiente anaeróbio, no qual um substrato orgânico serve como receptor de hidrogênio em lugar do oxigênio. Nos testes bacteriológicos esta reação é detectada pela mudança da cor dos indicadores de pH quando produtos ácidos são formados. Esta acidificação ocorre pela degradação de carboidratos por vias diferentes das estritamente fermentativas. Como a maior parte das bactérias que utilizam os carboidratos são anaeróbias facultativas, esta utilização nem sempre se dá sob condições estritamente anaeróbias. A mudança da cor do meio que contem o indicador azul de bromotimol, de verde para amarelo, indica uma reação positiva para os “açúcares” em geral. A prova de fermentação de glicose deve ser obrigatoriamente positiva para todas as enterobactérias, devendo-se atentar para o fato de que, nos casos de bactérias que produzem H2S ou hidrolisam a uréia, a cor amarela é mascarada (UFSC, 2005).

Outra prova realizado no meio Rugai, que vem abaixo da prova de fermentação de glicose é a prova de produção de gás. A origem do gás formado por bactérias fermentadoras vem da degradação do ácido fórmico com a formação de hidrogênio e gás CO2, facilmente observado pela presença de bolhas gasosas no meio de cultivo ((LABCLIN, 2009).

Seguido da prova de formação de gás temos a prova de Fenilalanina. O teste de fenilalanina serve para verificar a capacidade da bactéria em produzir ácido fenilpirúvico a partir da fenilalanina por ação enzimática. As bactérias que produzem a enzima desaminase da fenilalanina desaminam este aminoácido produzindo ácido fenilpirúvico. O reagente cloreto de ferro reage com o ácido fenilpirúvico, formando um composto verde. Nas culturas em que não ocorrer a desaminação da fenilalanina não há mudança de cor após a adição do reagente (UNESP, 2012).

A próxima prova bioquímica realizada no meio de Rugai é a prova da uréia. Esta prova tem por objetivo verificar se a bactéria produz urease e tem como princípio a hidrólise da uréia presente no meio. A hidrólise da uréia é feita pela urease produzida por muitas espécies de microorganismos.