AULA PRATICA DE BIOQUIMICA

AULA PRÁTICA DE CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS

PROCEDIMENTOS:

Na referida aula, foram realizados testes de precipitação de proteínas com os seguintes reagentes: reação de Heller; reação com metais pesados; reação TCA – ácido tricloroacético; com aquecimento; reação de Biureto.

MATERIAIS UTILIZADOS:

Tubos de ensaio, grade de suporte, pipetas automática e graduada, bico de Bunsen.

METODOLOGIA:

1) REAÇÃO DE HELLER: Pipetar 1 mL de HNO3 em um tubo de ensaio e adicionado lentamente 1 mL de solução de proteína (clara de ovo). Observar a formação da zona de interface.

2) REAÇÃO COM METAIS PESADOS: Pipetar 2 mL da solução de proteína (clara de ovo) em um tubo de ensaio e adicionar lentamente com o auxílio de um conta gotas o acetato de chumbo 5% (CH3COO)2Pb até perceber a alteração na solução.

3) REAÇÃO TCA (ÁCIDO TRICLOROACÉTICO): em um tubo de ensaio pipetar 2mL de solução de proteína (clara de ovo), em seguida adicionar com o auxílio do conta gotas o ácido tricloroacético (TCA) à 10% até perceber a mudança na solução (com 2 gotas já pode-se observar a mudança na solução).

4) AQUECIMENTO: em um tubo de ensaio pipetar 2 mL de solução de proteína (clara de ovo) Com o auxílio de uma pinça de madeira levar ao aquecimento a solução no bico de Bunsen, até observar a mudança na solução.

5) REAÇÃO DE BIURETO: em um tubo de ensaio pipetar 1 mL de solução de proteína (clara de ovo) e 1 mL de reativo de Biureto.

RESULTADOS

REAÇÃO DE HELLER  Separação da proteína e do ácido por um Anel Amarelado – zona de interface.

METAIS PESADOS  Solução esbranquiçada, ppt (precipitado) branco.

TCA  Ppt (precipitado) branco com apenas 2 gotas de TCA.

CALOR  Solução leitosa, ppt (precipitado) branco, superfície gelatinosa.

BIURETO  Solução violeta, com formação de ppt (precipitado) gelatinoso.

VIDRARIAS POR GRUPO:

 PINÇA DE MADEIRA

 5 PIPETAS PASTEUR

 PÊRAS E PUMPS

 2 CONTA-GOTAS

 5 TUBOS DE ENSAIO

 1 OVO POR AULA

SOLUÇÕES:

 ACETATO DE CHUMBO (5%):

PESAR 1,5G DE ACETATO DE CHUMBO E DISSOLVÊ-LO EM 30 ML DE ÁGUA DESTILADA.

FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA:

Precipitação de Proteínas com Desnaturação

As proteínas possuem uma estrutura tridimensional bem definida que está relacionada com suas propriedades físicas e biológicas. A modificação na estrutura tridimensional nativa de uma proteína, com a conseqüente alteração de suas propriedades é conhecida como desnaturação. A desnaturação envolve alterações nas estruturas quaternária, terciária e secundária de proteínas, mas não da primária.

A desnaturação, usualmente decresce a solubilidade das proteínas. A diminuição da solubilidade pode ser explicada pela exposição de radicais hidrofóbicos e outros que prejudiquem a interação proteína-água e favoreçam a interação proteína-proteína. A desnaturação é o evento primário e importante. A floculação e a coagulação, que muitas vezes são confundidos com desnaturação de proteínas, são simplesmente manifestações visíveis das alterações estruturais causadas pelos agentes desnaturantes.

Existem vários agentes desnaturantes de proteínas, tais como: calor, ácidos, álcalis, solventes orgânicos, soluções concentradas de uréia e guanidina, detergentes, sais de metais pesados, etc. Entre as alterações que se observam em decorrência da desnaturação protéica, pode-se citar: diminuição da solubilidade, perda de atividade biológica (por exemplo, da ação enzimática, da ação hormonal), aumento da reatividade de radicais da cadeia polipeptídica, alterações na viscosidade e coeficiente de sedimentação, etc.

A precipitação com desnaturação, além de serem utilizadas para caracterizar a presença de proteínas em solução, também são úteis para proceder a desprotenização de líquidos biológicos para análise de componentes não protéicos.

Reação de Heller:

Quando adicionamos um ácido ao meio onde a proteína está dissolvida, a liberação de prótons para o meio provoca uma queda do pH. Os aminoácidos ácidos (aspartato e glutamato) captam os prótons dissociados que se ligam à carboxila que estava dissociada. Isto implica em uma redução das cargas negativas existentes nesta proteína, que passa a ter uma carga positiva em decorrência dos nitrogênios, existentes nos aminoácidos básicos (lisina, arginina e histidina), estarem carregados positivamente. Uma das forças que mantém estável a estrutura globular de uma proteína é a ligação iônica entre a carboxila (negativa) de um aminoácido ácido e o nitrogênio carregado com um próton de um aminoácido básico (positivo).

Se as carboxilas captarem prótons, anulando, desta forma, suas cargas, conclui-se que as ligações iônicas entre elas e os radicais básicos foram desfeitas.

Mais uma vez proteína se precipita que pela exposição dos radicais apolares hidrofóbicos que estavam no interior, quer seja pela formação de sais insolúveis entre os radicais básicos e os ânions dissociados provenientes do ácido que foi acrescido ao meio.

Reação com Metais pesados:

A adição de sais de metais pesados, tais como mercúrio, chumbo, cobre e zinco, levam à formação de sais denominados "quelatos" entre os aminoácidos ácidos e estes metais. A proteína precipita porque estes sais são insolúveis em água e também porque, com a quebra das ligações iônicas, os aminoácidos hidrofóbicos ficam mais expostos ao meio aquoso

Reação TCA (ácido tricloroacético):

Determinados agentes, como os reagentes para alcalóides podem ser usados na precipitação de proteínas, o que e útil na desproteinização de materiais biológicos,