DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FUNDAMENTAIS E SOCIAIS

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FUNDAMENTAIS E SOCIAIS

PROFESSOR (A): Silvanda de Melo Silva

DISCIPLINA: Bioquímica

DISCENTE: Bruno Martins da Silva

ATIVIDADE ENZIMÁTICA

MINISTRANTES DA PRÁTICA:

        Alanne Lucena

Luana Ferreira dos Santos

Raylson de Sá Melo

Areia, Setembro de 2016

INTRODUÇÃO

   Podem ser compreendidos como enzimas os compostos orgânicos de natureza proteica que possuem capacidade catalítica – aceleram reações químicas. O estudo da catálise enzimática consiste, principalmente, no isolamento, na purificação e na caracterização funcional, termodinâmica, cinética e estrutural das enzimas (VENTURA et al. 2008).

   A enzima peroxidase é tida como uma das principais enzimas responsáveis pela deterioração da qualidade de muitos frutos congelados (CANO, ANCOS e LOBO, 1995). O escurecimento dos tecidos dos frutos ocorre principalmente pela oxidação enzimática dos compostos fenólicos, reação essa catalisada por duas enzimas: a polifenoloxidase e a peroxidase (BRAVERMAN, 1967).

   Em geral, na maior parte dos estudos cinéticos das atividades enzimáticas não é necessário utilizar equipamentos sofisticados ou formas purificadas de enzima, sendo os protocolos relativamente acessíveis e de fácil aplicação. A acumulação dos produtos das reações das peroxidases pode ocorrer durante a senescência dos frutos conferindo-lhes mudanças indesejáveis no gosto e aroma além de perda de nutrientes e escurecimento.

    Portanto, compreender os mecanismos da atividade enzimática é de extrema e fundamental importância para o engenheiro agrônomo, uma vez que estratégias para a conservação e melhor aproveitamento dos alimentos poderão ser traçados a partir deste conhecimento.  

        

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OBJETIVOS

• Compreender os princípios da atividade enzimática;

• Aferir de que maneira a velocidade de uma reação pode ser estimada;

• Utilizar na prática a equação de Michaelis-Menten;

        

MATERIAL E MÉTODOS

Materiais e reagentes:

Algodão;

Almofariz e Pistilo;

Bandejas;

Becker 250 mL;

Estantes para tubos;

Faca doméstica;

Bandejas;

Balança semi-analítica;

Material vegetal (Abacaxi);

Pipetas (1 e 5 mL);

Tubos de ensaio;

Funil plástico;

Espátulas;

Cubetas;

Banho de gelo;

Banho maria;

Reagentes e Soluções:

Água destilada;

Guaiacol 3%;

Peróxido de Hidrogênio 0,5 M;

Solução tampão fosfato de potássio

(100 mM, pH 7,0) bem gelado.

Preparo do extrato enzimático:

Para a preparação do extrato enzimático pesaram-se cerca de 2 g de polpa de abacaxi sendo esta homogeneizada juntamente com 5mL de solução tampão fosfato de potássio (100mM pH 7,0) bem gelada.  Após homogeneização o extrato foi filtrado em tecido de algodão e mantido em banho de gelo até sua posterior utilização.

Preparo das diferentes concentrações do substrato:

Foram enumerados sete tubos de ensaio (1-7) e adicionados aos mesmos diferentes concentrações de guaiacol (17, 33, 83, 167, 250, 333, 500 μL) à 12 molar e na sequência completado o volume de 1 mL com álcool etílico PA.

Preparo da mistura de ensaio:

Em outros sete tubos de ensaio enumerados (1-7) foram adicionados 1,5 mL do tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 7,0) e adicionado 0,1 mL da solução de guaiacol + álcool etílico PA aos tubos contendo as respectivas numerações. Foram adicionados comumente aos sete tubos de ensaio 0,2 mL de peróxido de hidrogênio 0,5 M e 0,2 mL do extrato enzimático.

Findadas as etapas descritas anteriormente, os tubos de ensaio seguiram para o espectrofotômetro, onde foram realizadas leituras de absorbância e anotados os valores obtidos para os respectivos frascos. Foram realizadas 6 leituras obedecendo um intervalo de 5 segundos entre uma leitura e outra, o que totalizou 30 segundos de atuação enzimática monitorada.

Resultados e discussão

A partir da leitura dos dados de absorbância anotados para cada tubo, foi possível construir os gráficos de reação enzimática (quantidade de produto formado em função do tempo) e da velocidade da reação: [pic 2]