Ciências da Nutrição Genética Geral Automatismos

Universidade Católica Portuguesa

Ciências da Nutrição

Genética Geral I

 

Extração de DNA

Quantificação e avaliação da pureza do DNA

Propriedades físico-químicas do DNA

Genotipagem- autenticidade de produto alimentar por PCR

Eletroforese em gel de agarose de produtos por PCR

Carolina Barrosa Carvalho Caldas Alves

Carolina Espínola Silva

Maria Inês Abreu Pinto

Maria Rita Furtado Martins Gagliardini Graça

Turma B

Data de realização: 18/09/2019, 25/09/2019, 02/10/2019 e 09/10/2019

Data de entrega: 18/09/2019

Sumário

No âmbito da disciplina Genética Geral, foram desenvolvidos trabalhos laboratoriais que tiveram como principais objetivos a extração, quantificação, avaliação da pureza de DNA e estudo das suas propriedades físico-químicas, bem como a genotipagem por PCR apreciação dos mesmo por eletroforese em gel de agarose.

Para tal, foi realizada a extração do DNA de um quivi de modo a obter uma quantidade de DNA puro, quantificando-se a pureza da amostra de DNA recolhida através do espectrofotómetro e comparando-se vários níveis de absorvância. Seguidamente, realizou-se testes das propriedades físico-químicas através de tratamentos térmicos com e sem sal.

Após a comparação de absorvâncias, concluiu-se que amostra de DNA estava contaminada por proteínas. Também foi possível observar que a molécula de DNA, quando exposta a alterações de temperatura e variações de salinidade, sofre alterações.

Posteriormente, comparou-se diferentes amostras de DNA obtidas por eletroforese em gel de agarose, tendo sido previamente preparadas por RAPD.

Conclui-se, assim que B2 e B4 correspondem ao DNA da banana, B1 e B3 provêm do DNA do quivi (embora com alguns erros experimentais), o controlo positivo funcionou como previsto, enquanto o controlo negativo apresentou algumas anomalias.

Índice

Introdução………………………………………………………………………….

Material e Métodos…………………………………………………………………

Resultados…………………………………………………………………………..

Discussão……………………………………………………………………………

Conclusão……………………………………………………………………………

Bibliografia………………………………………………………………………….

Introdução

        O ácido desoxirribonucleico (DNA) tem como constituintes um grupo fosfato, que apresenta carga negativa, uma pentose (desoxirribose) e bases azotadas (guanina, citosina, adenina e timina).

        Segundo James Watson e Francis Crick, o DNA é descrito como tendo uma estrutura em dupla hélice: as duas cadeias que as constituem estão ligadas por pontes de hidrogénio entre as bases azotadas. Estas por sua vez ligam-se entre si através do grupo fosfato. As cadeias de DNA estão dispostas em paralelo, mas em sentidos opostos: são antiparalelas, ou seja, o nucleótido da extremidade 5` de uma cadeia liga-se ao nucleótido da extremidade 3’ da cadeia complementar (Regateiro, F.;2007).

        A enzima desoxirribonuclease (DNase) tem a capacidade de degradar o DNA em nucleótidos, pois hidrolisa as ligações entre o carbono 3 e o carbono 5.

        Segundo o mesmo autor, as ligações de hidrogénio anteriormente referidas também podem ser destruídas: o DNA é desnaturado, tanto pela ação do aumento de temperatura, como pela alteração do pH (muito ácido ou muito alcalino). Este fenómeno é reversível através da reposição das condições ótimas do DNA.

        A replicação do DNA é um processo semi-conservativo, uma vez que uma das cadeias originais serve de molde para a formação de uma nova cadeia complementar.

        A iniciação da replicação acontece devido à ação da enzima helicase: as cadeias de DNA desenrolam-se e a pontes de hidrogénio são quebradas. Inicia-se em zonas onde haja bases Adenina-Timina abundantemente uma vez que é mais fácil quebrar estas ligações do que as bases Citosina-Guanina.

        Seguidamente, as duas cadeias separam-se e os nucleótidos livres na matriz ligam-se por complementaridade às cadeias originais, devido à DNA polimerase. No final, formam-se duas novas cadeias que estão ligadas às duas cadeias originais.

        A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica utilizada para obter várias cópias a partir de um fragmento específico de DNA. Este método divide-se em três fases: Desnaturação de DNA, annealing e extensão e para a sua realização é necessária uma solução com dNTPs (nucleótidos livres), iniciador forward, iniciador reverse, Taq polimerase e DNA.

        A desnaturação do DNA ocorre devido a presenças de temperaturas muito elevadas. Durante o annealing, o iniciador forward e o iniciador reverse ligam-se cada um a uma cadeia simples distinta. A extensão caracteriza-se pela formação das cadeias novas através da ação da Taq polimerase e dos dNTPs. O PCR costuma ser realizado em vários ciclos para aumentar a eficácia da amplificação.

Material e Métodos

Extração do DNA

Inicialmente, cortou-se com um bisturi 3mm de quivi sem sementes e colocou-se num saco de plástico para homogeneização esterilizada, esmagando manualmente até se obter uma massa homogénea. De seguida, pesou-se 0,5g da mesma para um tubo eppendorf e pipetou-se solução tampão de extração, que continha 10mM Tris-HCL, pH 8,2, 10mM EDTA e 0,15M NaCl. Homogeneizou-se no vórtex durante 30 segundos.

Posteriormente, pipetou-se 150µL de SDS 25% e 350µL de NaCl 5M. Após a sua homogeneização, incubou-se a 65ºC durante 20 minutos.