Relatorio Coloração De Gram

INTRODUÇÃO

Preparações de lâminas fixadas e coradas

Esfregaço

Consiste em uma preparação seca de células microbianas em uma lâmina de vidro, onde devem ser espalhados em determinada concentração, de modo que fiquem separados uns dos outros, formando uma fina camada esbranquiçada. [4]

• Meios de cultura líquida: deve-se mergulhar a alça de semeadura bacteriológica flambada na suspensão microbiana e a coloca diretamente no centro da lâmina, depois, espalhar o material com o mesmo instrumento, de modo a ocupar uma área de aproximadamente 1 cm ou 2 cm. A alça sempre deve ser flambada, tanto antes do esfregaço quanto depois. [4]

• Meios de cultura sólida: deve-se colocar uma gota de água destilada no centro da lâmina e com a alça retirar uma pequena quantidade do inóculo para suspender e homogeneizar nessa gota, depois espalhar a suspensão de forma idêntica aos meios de cultura líquida. [4]

Fixação

A fixação pelo calor permite preservar a forma do microrganismo, mas alguns componentes celulares podem ser danificados. Durante o processo, as enzimas que podiam alterar a morfologia celular são inativadas, as estruturas celulares são endurecidas para que não se alterem durante a coloração e observação e as proteínas microbianas coagulam e fixam-se à superfície da lâmina. [4]

Para que as células fiquem aderentes ao vidro, deve-se segurar a lâmina de um lado e fazer de 2 a 3 passagens pela chama do bico de Bunsen. Se o esfregaço não está fixado ao vidro da lâmina ele será removido durante a fase de coloração. [4]

Coloração simples

Método onde o esfregaço é corado com um só reagente, de modo que todas as estruturas ficam coradas da mesma cor, podendo observar a dimensão, a forma e o arranjo das células microbianas. Os corantes básicos, com o cromógeno carregado positivamente, se ligam aos ácidos nucléicos e a certos componentes da parede celular. [2]

Os corantes básicos mais usados são:

• Azul de metileno (cora de azul)

• Violeta cristal (cora de roxo)

• Fuscina (cora de vermelho)

• Roxo de metilo (cora de roxo)

• Verde de malaquita (cora de verde)

Coloração diferenciada: coloração de Gram

É um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1853 - 1838), em 1884, que consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes: cristal violeta, lugol, etanol-acetona (álcool 95%) e fucsina básica. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em Gram-positivas e Gram-negativas e a determinação da morfologia e do tamanho das amostras analisadas. Quando examinadas ao microscópio óptico, usando a objetiva de imersão, as bactérias Gram-negativas aparecem coradas de vermelho e as Gram-positivas de roxo (violeta azulado). [1]

Coloração especial: colorações estruturais

Algumas bactérias dos géneros Bacillus, Clostridium produzem endosporos, estruturas resistentes que sobrevivem em condições ambientais adversas, assim, utilizando o verde de malaquita que resiste a lavagem, o resto da célula que descorou pode ser corado com um segundo corante como a safranina. Outras bactérias possuem cápsulas externas, que possuem uma coloração mais fraca do que a célula, podendo ser identificadas com o corante vermelho do Congo. [3]

OBJETIVOS

Introduzir a técnica de coloração diferencial de bactérias, método de Gram, identificando na prática bactérias Gram positiva e Gram negativa.

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais

• Microscópio

• Óleo de imersão

• Lâminas e lamínulas

• Alça de platina

• Tubos de ensaio

• Bico de Bunsen

• Azul de metileno

• Pissetas com água destilada

• Recipiente com água

• Grampo

• Corantes: violeta cristal e fuscina

• Lugol (mordente)

• Álcool 95%

Microrganismos:

• Escherichia coli

• Staphylococcus

Métodos:

Para a realização do esfregaço, foi colocada uma gota de água destilada sobre uma lâmina seca e limpa e deixado próximo a área estéril do bico de Bunsen. Após, foi utilizado uma alça de platina, que estava em um tubo de ensaio contendo álcool, para fazer a devida assepsia na chama e depois usado para retirar uma pequena porção tanto de Escherichia coli quanto de Staphylococcus. Então, foi colocada a porção na gota e esfregada levemente com a alça para que ela se espalhe, e para que a amostra ficasse devidamente fixada na lâmina, foi passada rapidamente três vezes sobre a chama e então deixada no balcão para que esfriasse e secasse