CARACTERIZAÇÃO DE UMA ENZIMA MITOCONDRIAL: DESIDROGENASE SUCCÍNICA

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PRÁTICA 4 – CARACTERIZAÇÃO DE UMA ENZIMA MITOCONDRIAL: DESIDROGENASE SUCCÍNICA

DANIELE HARUMI ESSUMI

PRESIDENTE PRUDENTE - SP

MARÇO/2019

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SUMÁRIO

INTRODUÇÃO        3

OBJETIVOS        6

PARTE EXPERIMENTAL        6

RESULTADOS E DISCUSSÃO        9

CONCLUSÕES        15

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS        157

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INTRODUÇÃO

Para o estudo das enzimas, realizações de experimentos e análise geral, é necessário primeiramente saber a respeito das funções desta. Para o experimento de enzimas, sempre verifica-se a reação que esta   catalisa e como é a sua participação (a maioria das reações com enzimas fazem parte de uma via metabólica). O isolamento da enzima tem a finalidade de investigar o mecanismo de reação, medir os parâmetros cinéticos e determinar a estrutura da proteína e/ou obter detalhes do seu sítio ativo. [1]

As enzimas são as responsáveis por acelerar as reações químicas do metabolismo, portanto o seu funcionamento é de grande importância. A enzima possui uma parte chamada sítio ativo que é onde ocorre a ligação ao substrato (substância que sofre transformação), formando um complexo intermediário, que enfraquece as ligações do substrato gerando os produtos (substancia que resulta da transformação do substrato) que ao fim são liberados. [2]

E a reação enzimática pode ser escrita genericamente pela equação:

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Onde: E= enzima; S= substrato e P= produto

Equação 1 – Ação enzimática genérica

Figura 1: Reação enzimática, representando a equação 1.

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Fonte: https://www.infoescola.com/bioquimica/enzimas/

As enzimas são muito específicas para os seus substratos (esta especificidade pode ser relativa a apenas um substrato ou a vários substratos ao mesmo tempo). [4] E alguns modelos procuram explicar a especificidade substrato/enzima, como na figura 2.

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Figura 2: Reação enzimática. A) modelo chave/fechadura B) Modelo de ajusto induzido.

1. Modelo Chave/Fechadura : Prevê um encaixe perfeito do substrato no sítio de ligação, que seria rígido como uma fechadura.
2. Modelo do Ajuste Induzido : Prevê um sítio de ligação não totalmente pré-formado, nas sim moldável à molécula do substrato; a enzima se ajustaria à molécula do substrato na sua presença.

Evidências experimentais sugerem um terceiro modelo que combina o ajuste induzido a uma "torção" da molécula do substrato, que o "ativaria" e o prepararia para a sua transformação em produto.

As atividades das enzimas podem ser controladas pelos chamados moduladores, os mais conhecidos são o pH e a temperatura que possuem um valor adequado para que cada enzima trabalhe em sua velocidade máxima. As enzimas também podem ser controladas por algumas substâncias que possuem a capacidade de minimizar ou interromper as suas funções, são conhecidos como inibidores enzimáticos. [5] Existem basicamente dois tipos de inibidores, os reversíveis e os irreversíveis.

INIBIÇÃO REVERSÍVEL	Inibidor competitivo	Compete com o substrato, liga-se ao sítio ativo da enzima e impede a ligação do substrato com a enzima.
Inibidor incompetitivo	Liga-se ao sítio não ativo, quando já ocorreu a formação do complexo enzima-substrato, diminuindo a velocidade da reação.
Inibidor não competitivo (mista)	O inibidor pode se ligar tanto na enzima quanto no complexo enzima-substrato, sempre em um sítio diferente do ativo.
INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL	Ocorre da destruição da enzima, da formação de uma ligação covalente inibidor-enzima ou até mesmo de uma ligação não covalente (estável).

Tabela 1: Tipos e definições de inibidores. [2]

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Figura 3: Três tipos de inibição reversível. A) Inibição competitiva. B) Inibição incopetitiva.

C) Inibição mista. [2]

OBJETIVOS

• Demonstrar a técnica de isolamento de mitocôndrias.
• Caracterizar a presença de desidrogenase succínica na fração mitocondrial.
• Reforçar os conhecimentos sobre propriedades das enzimas.
• Demonstrar a inibição enzimática competitiva.

PARTE EXPERIMENTAL 

Materiais e reagentes

• Meio de extração: sacarose 0,32 mol.L-1 em tampão fosfato 0,02 mol.L-1
  contendo EDTA 0,01 mol.L-1;
• Cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio a 0,56 g% pH 7,3;
• Succinato de sódio 0,5 mol.L-1 pH 7,3;
• Malonato de sódio 0,5 mol.L-1 pH 7,3;
• Suspensão de mitocôndrias (contendo a desidrogenase succínica) com
  concentração de proteínas entre 40 e 50 mg/mL;
• Tampão fosfato 0,02 mol.L-1 pH 7,3;
• Solução padrão de proteínas 5 mg/mL;
• Reagente biureto
• Fígado fresco de boi;
• Água destilada;
• Gelo triturado;
• Almofariz e pistilo;
• Centrífuga refrigerada;
• Espectrofotômetro;
• Béquer de 250 mL;
• Tubos plásticos de centrífuga;
• Erlenmeyer de 125 mL;
• Gaze;
• Bastão de vidro;
• Pipetas volumétricas (1 de 5 mL, 1 de 2 mL e 7 unidades de 1 mL)
• 11 tubos de ensaio;

Procedimentos experimentais

Preparo das mitocôndrias

Recebeu-se 50 g de fígado de boi picado e mantido em refrigeração, transferiu-se
para um almofariz e macerou-se com a ajuda de um pistilo. Aos poucos, adicionou-se cerca de 50 mL de meio de extração gelado, triturou-se. Em seguida, filtrou-se em gaze, para reter as partículas maiores. O filtrado foi recolhido em um erlenmeyer e transferiu-se para um tubo de plástico de centrífuga também resfriado em banho de gelo. O
tubo foi equilibrado com outro tubo de outro grupo, usou-se a balança para obter o mesmo peso e centrifugou-se por 10 minutos 2000 rpm. Desprezou-se o sedimentado, colocou-se o sobrenadante novamente no tubos plástico de centrífuga, balanceou-se com o do outro grupo e centrifugou em refrigeração por 20 minutos à 6000 rpm. Ao
fim dessa segunda centrifugação, desprezou-se o sobrenadante e solubilizou-se o material
sedimentado a um volume total de 6 mL com meio de extração gelado.
Pegou-se 1 mL dessa solução, colocou-se em um tubo de ensaio e levou-se ao
banho-maria fervente por cerca de 5 minutos. E o restante usou-se para a quantificação da proteína na enzima mitocondrial e na determinação da atividade de desidrogenase, que será descritas a seguir.