ELETROSMOSE E ELETROFORESE

ELETROFORESE

A Eletroforese, ferramenta amplamente utilizada no meio científico, é uma técnica baseada na separação de partículas em um determinado gel de acordo com sua massa e carga.. A eletroforese pode ser utilizada para separação de diversas moléculas orgânicas, como lipoproteínas, proteínas, RNA e DNA. O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA se baseia na carga negativa global de uma fita de DNA. Portanto, íons livres , moléculas de DNA ou fragmentos de DNA em uma solução podem ser separados aplicando–se uma certa voltagem. Ao final do processo as cadeias de DNA estarão próximas ao catodo (positivo), que atrai, devido à polaridade, moléculas de carga negativa. O gel de poliacrilamida forma uma malha constituida por uma rede de polímeros que permite a migração de moléculas. Moléculas de menor peso molecular terão mais facilidade em atravessar a malha do gel, se posicionando assim mais próximas do catodo; enquanto as moleculas com maior peso apresentam maior dificuldade e se posicionam mais próximas do anodo. A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. São os marcadores de tamanho molecular (Ladders = Escadas), que são misturas de trechos de DNA com tamanhos variáveis.

Existem dois modelos básicos de eletroforese: Baseada em géis de agarose ou em géis de poliacrilamida. As duas substâncias formam tramas de poros de tamanhos variáveis, possibilitando a separação dos fragmentos, que terá sua eficiência dependente da concentração do polímero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicada.

- acrilamida (C 3 H 5 NO) 30% 1,079 ml

- perssulfato de amônio(APS) 40 m l

-Catalisada por TEMED (N,N,N´,N´-Tetrametiletilenodiamino) 4 m l

- Tampão de TBE 10X 0,65 ml

- Água destilada 3,22 ml

Fig. 1 - Gel de poliacrilamida em polimerização. Pode-se visualizar o pente ainda inserido no sistema.

Solução de acrilamida 30%

- acrilamida 290 g

- Bis-Acrilamida (N,N´- Metileno-bis-acrilamida) 10 g

- Água destilada (completar para) 1000 ml

Solução de TBE 20X

Já a solução de TBE 20X é feita da forma que se segue abaixo e dissolvida para a concentração desejada conforme a necessidade.

- Tris Base 121,0g

- Ácido Bórico 61,7 g

- EDTA 7,9 g

- Água destilada (completar para) 1000 ml

- Ajustar pH para 8,3

Corrida do Gel

Após a polimerização, os procedimentos são:

• cobertura