Reação em cadeia da polimerase (PCR)

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Agora que tantas sequencias genômicas estão disponíveis, os genes podem ser clonados sem a necessidade de primeiro construir bibliotecas de DNA, a técnica de PCR possibilita essa clonagem rápida. Começando com um genoma inteiro, a PCR permite que o DNA de uma região selecionada seja amplificado vários bilhões de vezes, purificando efetivamente esse DNA do restante do genoma.

Para começar um par de ligonucleotideos de DNA (Iniciadores ou primers) escolhidos para se ligar a sequencia de nucleotídeos deseja do gene, é sintetizado por métodos químicos. Esses iniciadores são então utilizados para iniciar a síntese de DNA nas fitas simples geradas pelo aquecimento do DNA do genoma inteiro. O DNA novo sintetizado é produzido em uma reação catalisada in vitro por uma DNA-polimerase (TAQ polimerase) purificada, e os iniciadores permanecem nas extremidades 5’ dos fragmentos finais de DNA que são produzidos.

A eficácia da PCR é revelada apenas depois de repetidos ciclos de sintese de DNA, cada ciclo duplica a quantidade de DNA sintetizada no ciclo anterior. Com cada ciclo da síntese de DNA, os fragmentos novos gerados servem como molde na sua vez, e dentro de poucos ciclos o produto predominante é uma espécie única de fragmentos de DNA, cujo o comprimento corresponde a distancia entre os dois iniciadores originais.

A PCR portanto torna possível a” clonagem molecular livre de células” de um fragmento de DNA em poucas horas em comparação com os vários dias necessários para os procedimentos normais de clonagem. O método de PCR é extremamente sensível, pode detectar uma única molécula de DNA em uma amostra. Os traços de RNA podem ser analisados da mesma maneira, sendo transcritos prirmeiro em DNA pela transcriptase reversa. A PCR ainda é muito usada para diagnostico de doenças genéticas, detecacao de baixos níveis de infecção viral e medicina forense.

Resumo das Clonagem e Amplificação por PCR

Produção de Proteínas Específicas

Grandes quantidades de uma proteína desejada são produzidas em células vivas utilizando vetores de expressão que em geral são plasmídeos projetados para produzir grandes quantidades de um mRNA estável que pode ser traduzido eficientemente em proteína em bactéria, levedura, inseto ou célula de mamífero transfectadas. Para prevenir que a grande quantidade da proteína estranha interfira com o crescimento da célula transfectadas o vetor de expressão muitas vezes é projetado para retardar a síntese do mRNA estranho e da proteína até um pouco antes das células serem coletadas e rompidas.

Como a proteína desejada é produzida a partir de um vetor de expressão dentro de uma célula, ela deve ser purificada das proteínas da célula hospedeira por cromatografia, após a lise das células. Existem vários vetores de expressão projetados para adicionar um marcador molecular (como um grupo de resíduos de histidina ou pequena proteína marcadora) à proteína expressa para permitir uma purificação fácil por cromatografia de afinidade. Uma variedade de vetores de expressão esta disponível, cada um modificado por engenharia genética para funcionar em um tipo de célula na qual a proteína devera ser produzida, dessa maneira as células podem ser induzidas a produzir vastas quantidades de proteínas uteis na medicina como hormônios, citocinas e antígenos virais para vacinas.

Sequenciamento de DNA

Métodos que permitem que uma sequencia de nucleotídeos de qualquer fragmento de DNA seja determinada de forma simples e rápida tornaram possível determinar as sequencias de DNA de dezenas de milhares de genes e de vários genomas completos. O volume de informação da sequencia de DNA agora é tão grande que computadores potentes devem ser utilizados para armazená-lo e analisa-lo. Agora com o sequenciamento de DNA é possível determinar indiretamente as sequencias de aminoácidos da maioria das proteínas.

EXPRESSÃO GÊNICA EM EUCARIOTOS

Processamento do RNA

A transcrição de DNA para RNA ocorre por meio da ação da RNA polimerase, contudo existem diferenças nesse processo quando comparamos organismos eucariotos e procariotos. Entre essas diferenças, podemos destacar que nos organismos eucariotos ocorre adição de 7-metilguanosina à extremidade 5’ do RNA, além disto existe uma sequência AAUAAA que determina uma região de clivagem que sofrerá ação da Endonuclease, podemos destacar também que ao final deste RNAm ocorre adição de uma cauda poliA; deste modo, toda porção terminal de RNAm de eucarioto é rica em Adenina.

O RNAm de eucariotos é constituído de éxons e íntrons, sabemos que estes últimos devem ser retirados para que ocorra a tradução do RNAm à proteína. Estas regiões (íntrons) são iniciadas pela sequencia GU e terminam com uma sequencia AG, sendo comum se observar a presença de uma resíduo de Adenina na região central do íntron ( regra GU---A---AG). Este tipo de constituição do DNA ( éxons e íntrons) permite que ocorra um processo chamando de splicing alternativo, com isto temos um mesmo gene produzindo diferentes proteínas devido ao processo de eliminação dos íntrons e ligação dos éxons por meio das enzimas de recomposição.

A maquinaria celular dos organismos eucariotos é bem mais sofisticada e complexa do que a maquinaria celular dos procariotos, desse modo ptns que necessitam de modificações pós-traducionais são produzidas em sistemas com células de eucariotos.

As proteínas de eucariotos produzidas em bactérias são instáveis e na maioria das vezes inativas, em geral nas ptns obtidas por meio de procariotos há a possibilidade da existência de pirogênio e resíduos tóxicos mesmo após a etapa de purificação da ptn; estes fatores somados a necessidade de modificações pós-traducionais de algumas ptns e a necessidade de as ptns médicas serem idênticas as ptns naturais podem ser entendidos como vantagens para o uso de organismos eucariotos. Porém o que de fato determina o tipo celular utilizado é a complexidade da ptn a ser produzida.

A escolha do sistema de expressão depende de: 1-qualidade da ptn que se deseja, 2- rendimento do produção, 3- custo de produção, 4- etapas de purificação.

Vetores

Quanto aos vetores empregados, esses são semelhantes aos vetores de procariotos, possuindo, no entanto, sinais