As Pectinases são enzimas que catalisam a hidrólise de substâncias pécticas presentes nas células vegetais

INTRODUÇÃO

As pectinases são enzimas que catalisam a hidrólise de substâncias pécticas presentes nas células vegetais. Estas correspondem a cerca de um quinto do mercado mundial de enzimas (CAMARGO et al., 2005; UENOJO & PASTORE, 2007). Tais enzimas são sintetizadas por diversos organismos vivos como fungos filamentosos, plantas, bactérias, leveduras entre outros (SANTI et al. 2014). Porém, na literatura predominam estudos da produção de pectinases por fungos filamentosos, uma vez que a maioria das enzimas utilizadas comercialmente provém destes micro-organismos (SANTI et al.,2014).

A pectina liase é a única capaz de degradar uma molécula de pectina altamente ramificada sem o auxílio prévio de pectinesterase que é uma enzima hidrolítica (CAMARGO et al., 2005). A pectina liase (polimetilgalacturnato liase, PMGL) catalisa a β- eliminação entre dois resíduos de ácido galacturônico mais ou menos esterificados. Quebram as ligações por transeliminação do hidrogênio dos carbonos das posições 4 e 5 da porção aglicona do substrato (pectina)10,15,32 de modo endo ou exo (UENOJO & PASTORE, 2007).

Os mecanismos de catalise das pectinases, fazem com que estas enzimas sejam amplamente utilizadas em indústrias de alimentos, na fermentação de chá, café e cacau, na extração de óleos vegetais, no processamento de vinhos, na estratificação e clarificação de sucos de frutas e na indústria têxtil e de celulose (CAMARGO et al., 2005; UENOJO & PASTORE, 2007).

Para a produção das pectinases é necessário a utilização de fontes de carbono indutores (substrato) com baixo custo de mercado. Existem diversos resíduos sendo estudados principalmente aqueles gerados a partir de frutas cítricas, como polpa de laranja, além de polpa de maracujá e de uva visando à redução do custo de produção de enzimas (KOSER et al., 2014; GERHARDT et al., 2015). Em relação às pectinases, objetiva-se utilizar subprodutos que contenham pectina, servindo como fontes indutoras de baixo custo (IRSHAD et al., 2014; KOSER et al., 2014).

Uma alternativa é fruto de buriti (Mauritia flexuosa), uma palmeira típica de ambientes úmidos. Seus frutos são ricos em vitaminas A, B, C, E, fibras, óleos insaturados e ferro, sendo amplamente utilizados na fabricação de doces, sucos e óleo. Dessa forma, essa frutífera pode ser considerada uma alternativa à essa demanda, visto que possui ampla ocorrência na Amazônia, Cerrado e Pantanal (SAMPAIO, 2011).

Neste contexto o presente estudo teve por objetivo avaliar a produção de pectina liase, o pH e a biomassa final em cultura mista de duas linhagens de fungos filamentos em meio contendo polpa de buriti como fonte de carbono indutora.

MATERIAL E MÉTODOS

Os fungos filamentosos foram isolados de amostras do solo em áreas de cultivo de cana de açúcar no município Nova Olímpia-MT, especificamente nos locais próximos aos sulcos de irrigação do vinhoto tratado por ser uma microrregião onde o solo tem uma temperatura mais elevada. Após coletada, as amostras de solo foram armazenadas em saco plásticos estéreis e transportadas em caixas isotérmicas para o Laboratório de Microbiologia/CPEDA do Campus Tangará da Serra da Universidade do Estado do Mato Grosso (UNEMAT).

O isolamento e seleção dos fungos do solo foi realizado por meio da técnica de diluição seriada (SILVA et al., 2010). Em seguida, para a ativação do complexo pectinolítico as linhagens foram cultivadas em meio de cultura contendo 1,25% de pectina cítrica, após, foram incubadas a 30 °C por um período de três dias. As linhagens pré-selecionadas pertencem a coleção do Laboratório de Microbiologia/CPEDA do Campus Tangará da Serra da UNEMAT 

Para obtenção da polpa do buriti, os frutos foram colocados de molho em água da torneira por um período de 24 h, após, a casca foi removida por raspagem, assim como a polpa (SAMPAIO, 2011). Após, a polpa foi lavadas duas vezes com água destilada, e seca em estufa com circulação de ar a 50 °C por 48h. Em seguida o material seco foi triturado em liquidificador industrial e peneirado em Tamis de 60 mesh.

As duas linhagens isoladas foram cultivadas juntas (Cultivo misto) em frascos contendo 20 mL de meio líquido mais sais (NH4)2SO2 0,1%, K2HPO4 e KH2PO4 0,09%, MgSO4 0,01%, com 1% de das fontes de carbono indutoras(Polpa de Buriti, e Pectina Cítrica como controle), pH ajustado em 5,0, inoculadas com 1 mL de uma suspensão contendo 107 esporos. mL-1 e incubadas em shaker rotatório a 40 °C, a 125 rpm por até 96 h. Após, o caldo de cultivo foi filtrado em papel Whatman® n. 1, foi aferido o pH final e estocado em banho de gelo para a determinação de atividade de pectina liase ( CAMARGO et al; 2005).

Para determinar a atividade de pectina liase foi adicionado em um erlenmeyer 10,0 mL do extrato bruto e 10,0 mL de pectina cítrica 0,5% em tampão acetato de sódio 0,05M com pH 4,5 e incubou-se em banho-maria a 40 °C por 60 min (SANTI, 2005). Após, foi pipetado alíquotas de 3,0 mL da mistura nos tempos de 30 e 60 min e transferidas 1 mL para tubo de ensaio, 1,75 mL de HCl 0,5M, para a realização da leitura.

A absorbância foi medida em espectrofotômetro em comprimento de onda de 235 nm contra o branco (ALBERSHEIM & KILLIAS, 1962). O coeficiente de extinção molar utilizado para cálculo foi ε235nm = 5550 M-1cm-1 (UENOJO & PASTORE, 2006). Considerou-se uma Unidade enzimática (U) como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 μmol de ácido galactourônico mL-1.min-1 nas condições do ensaio (U= μmol.mL-1.min-1).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

No cultivo das duas linhagens de forma mista, a maior produção de pectina liase foi 20,99 U.m.L-1 com pectina cítrica como fonte indutora no tempo 96h. Enquanto o menor resultado obtido foi 5,82 U.mL-1, no tempo de 24h, com a polpa de buriti como fonte indutora. A avaliação da atividade enzimática nos tempos de 24h e 48h de incubação, apresentam produção enzimática igual para as duas fontes indutoras. Observou-se que produção enzimática começou a mudar após 72h de incubação, pois o meio com pectina cítrica houve um aumento gradual, já o meio com a polpa de buriti sofreu diminuição na produção. (Figura1).[pic 1]