Projeto de Biotecnologia de Células Vegetais

BIOTECNOLOGIA DE CÉLULAS VEGETAIS

O alumínio influencia o crescimento das raízes de Qualea grandiflora e Citrus limonia?

Aluna: Mariana Feitosa Cavalheiro

Orientador: Prof. Dr. Massanori Takaki

Rio Claro

Junho/2014

1. INTRODUÇÃO

O desenvolvimento e o crescimento das raízes são de extrema importância para o estabelecimento da planta no meio, uma vez que essas desempenham papéis intrínsecos para a sobrevivência da planta indivíduo, tais como: fixação e sustentação da parte aérea, armazenamento de reservas, síntese hormonal, além de absorção de água e nutrientes (RAVEN et al., 2007). O crescimento (radicular) envolve a divisão e a expansão celular, que pode ser prejudicada por elevadas concentrações de etileno (Et) e pela síntese ou distribuição ineficiente de ácido indol-acético (AIA) na raiz (MUDAY et al., 2012).

O alumínio (Al) é considerado tóxico à maioria das plantas, em especial àquelas de interesse comercial. Em concentrações elevadas de Al, plantas sensíveis desenvolvem raízes enegrecidas, quebradiças, grossas, podendo apresentar manchas necróticas, além de crescimento reduzido (FOY et al., 1978). Esses sintomas diminuem o sucesso de estabelecimento das plantas nesses solos, reduzindo suas produtividades.  

O limoeiro Cravo (Citrus limonia L.) é um dos principais porta-enxertos utilizados na citricultura nacional e paulista e, embora haja controvérsias na literatura, alguns estudos apontam que seja uma espécie sensível ao Al (SANTOS et al., 1999; PEREIRA et al., 2003). O AIA é responsável pela plasticidade da parede celular, favorecendo seu crescimento (PERILI et al., 2012). Esses autores também reforçam que o IAA é sintetizado no meristema apical caulinar, tendo como principal precursor o triptofano, envolvendo um complexo conjunto de genes. Perili et al. (2012), ainda referem que o transporte de IAA até raiz é realizado de maneira polar em tecidos onde não há vasos condutores, favorecendo principalmente o crescimento de raízes adventícias. Outros estudos sugerem que o Al interfere no crescimento radicular, prejudicando o transporte de AIA até a raiz, e não em seu processo de biossíntese (SUN, 2009).

No entanto, plantas selecionadas a viver em ambientes com solos extremamente ácidos e ricos em Al, como o solo do cerrado, apresentam estratégias para possível extrusão de Al ou a comprovada estratégia de acúmulo nos tecidos, principalmente os foliares (HARIDASAN, 2008). Em algumas espécies acumuladoras, como Qualea grandiflora (Vochysiaceae), o Al parece ser essencial ao crescimento e desenvolvimento da planta, embora as vias metabólicas ainda não estejam esclarecidas (HARIDASAN, 1982; 2008).

O projeto tem como objetivo testar a hipótese de altas concentrações de Al diminuem o crescimento das raízes de limoeiro Cravo, ao passo que beneficiam esse crescimento em espécies acumuladoras, como Q. grandiflora. A hipótese será testada após a germinação in vitro das sementes de ambas as espécies, através de medidas de crescimento radicular em dosagens crescentes de Al, a concentração de auxina nas raízes.

 

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Materiais Vegetais

Serão utilizados indivíduos de Qualea grandiflora e Citrus limonia recém- germinados (30-45 dias).

As espécies serão submetidas às seguintes concentrações de Al (solução de AlCl3; pH 4): 0, 10, 20, 30 e 40 mg/L.  Para cada tratamento, serão utilizados cinco exemplares de plântulas recém-germinadas de cada espécie que estarão dispostos em tubos de vidros (rizotrons), totalizando 25 indivíduos de Q. grandiflora e 25 indivíduos de C. limonia.

As sementes de Q. grandiflora terão suas dormências quebradas através do uso de ácido sulfúrico por 5 minutos, e serão lavadas por um dia, sendo esse procedimento dispensável no caso de C. limonia. Na câmara de fluxo laminar, sementes de Q. grandiflora e C. limonia serão desinfetadas em etanol 70% por 30 segundos e submetidas a hipoclorito de sódio (NaClO) 5% por 15 minutos, As sementes serão então inoculadas em frascos com capacidade de 250 mL, contendo 30 mL de meio nutritivo MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) suplementado com 6g/l de ágar-ágar (Difco), 100mg/l de mio-inosinol.

Os meios serão gelificados com ágar (6,0 g/L) e o pH ajustado para 4,0. Os frascos com as sementes serão incubados em câmara de germinação BOD, com temperatura ajustada para 30°C.

Após 30-45 dias, as sementes recém-germinadas serão transplantadas em rizotrons, que são tubos de ensaios (24,5 x 250 mm; TER 24250R, Vidrolabor, Brasil) com orifício (2 mm de diâmetro) no fundo para drenagem de água. Esses tubos serão dispostos em 45° em relação ao solo, para que o gravitropismo faça com que a raiz cresça sempre rente à parede de vidro, para observação e medição do crescimento. Tais rizotrons permanecerão em casa de vegetação, cuja temperatura média é de 20 a 30 °C.

O crescimento das raízes será acompanhado semanalmente, com marcações feitas por caneta retroprojetora no vidro dos tubos, até as raízes atingirem o fundo. Logo após a conclusão das medidas, os indivíduos testados serão retirados dos rizotrons, tendo suas raízes lavadas em água corrente e seus meristemas apicais radiculares removidos para medição da concentração de IAA.

2.2 Determinação da concentração endógena de IAA

Para a determinação de IAA, as amostras de raiz serão tratadas criogenicamente para que toda e qualquer atividade metabólica cesse. As amostras serão acondicionadas em ependorfs de 5 mL (resistentes à criogenia e ultra-baixas temperaturas) identificados, lacrados e armazenados em ultra freezer (-80ºC) para posterior análise. Dentro de caixas de isopor com gelo seco (CO2 sólido) as amostras seguirão para o Plant Biotechnology Institute, NRC-CNRC (Canadá).

Serão utilizados padrões autênticos (não deuterados) e deuterados (2H5 IAA) de ácido indol-3-acético a serem adquiridos do próprio NRC-CNRC. Os padrões deuterados serão adicionados às amostras no início do processo de extração, permitindo analisar posteriormente a taxa de recuperação do composto, dada pelo método de extração e tratamento da amostra. A taxa de recuperação do padrão deuterado será a mesma do analito, assumindo-se que a eficiência da extração será igual para ambos, além de compensar os efeitos de matriz (MÜLLER & MUNNÉ-BOSCH, 2011).