Relatorio Clonagem

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

FACULDADE DE BIOTECNOLOGIA

Clonagem – Relatório de aula prática

MARIA ELIZABETH MAUÉS DOS SANTOS

BELÉM – PA

2016

1. INTRODUÇÃO

A clonagem é um mecanismo comum de propagação da espécie em plantas ou bactérias. A primeira definição de clone foi dada de acordo com Webber (1903) um clone é definido como uma população de moléculas, células ou organismos que se originaram de uma única célula e que são idênticas à célula original e entre elas. Em humanos, os clones naturais são os gêmeos idênticos que se originam da divisão de um óvulo fertilizado (ZATZ, 2004). A clonagem artificial de organismos pode ser efetuada por métodos diferentes, como a transferência de núcleos de células somáticas.

A clonagem por transferência nuclear se baseia na substituição da cromatina de um óvulo maturado, ou seja, no estádio que ele estaria apto a ser fecundado, pelo núcleo de uma célula retirada do animal a ser clonado (TRECENTI & ZAPPA, 2013). A transferência de núcleos de células somáticas (TNCS) potencialmente pode ser usadas para produzir diferentes espécies, tais como ovelhas, gado , de cabra e porco ou animais clonados ilimitadas que manifestam naturalmente de alto desempenho ou outras características desejáveis (HWANG et al., 2015).

Os estudos sobre a clonagem têm evoluído em todo o mundo (VIEIRA, 2012).  A clonagem, atualmente, pode ser usada comercialmente em rebanhos para produzir cópias genômicas de animais de alto valor genético (GALLI et al., 1999) sendo que atualmente, a clonagem está restrita a rebanhos de elite e animais com características especiais (MEIRELLES et al., 2007). E também sendo usada na tentativa de preservação de espécies ameaçadas de extinção (LOI et al., 2001). A clonagem terapêutica representa também outra área de pesquisa com grande potencial de aplicação da transferência nuclear. O termo “clonagem terapêutica” se refere ao uso da transferência nuclear para produzir células ou tecidos que possam ser usados em diferentes tipos de terapias, incluindo o tratamento de doenças degenerativas, traumáticas, ou de origem genética (RHIND et al,2003).

1. METODOLOGIA

1. OBTENÇÃO E MATURAÇÃO DOS OOCITOS RECEPTORES

Os oocitos receptores são normalmente utilizados na fase final da maturação meiótica, quando se encontram no estádio de metáfase II (M-II). A maturação até o estádio de metáfase II pode ser feita in vivo e os oocitos recuperados dos ovidutos após a ovulação ou recuperados diretamente dos folículos no momento que antecede a ovulação. A maturação pode também ser feita in vitro onde os oocitos que se encontram no estádio de prófase I ou vesícula germinativa, são recuperados de folículos antrais e atingem estádio de metáfase II. As condições para a maturação são similares àquelas para a produção in vitro (PIV) de embriões, ou seja, meio TCM 199 suplementado com hormônios e antibióticos, mantidos em temperatura de 38,5–39,0°C durante 16–24 h em atmosfera com umidade saturada contendo 5% de CO2 em ar

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1. SELEÇÃO E PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS DOADORAS DE NÚCLEO

As células podem ser usadas diretamente após a coleta do animal doador ou seguido de um período de cultivo celular, bem como frescas ou após criopreservação. As células doadoras podem ser de qualquer linhagem, ou oriundas de qualquer tecido do animal doador, contanto que sejam células 2n. depois de selecionada a célula doadora de interesse acontece o processo de enucleação. O princípio básico da técnica consiste em promover a digestão da zona pelúcida de oócitos maturados, para, em seguida, com o auxílio de microlâminas, realizar-se a enucleação manual. As interações citoplastos e núcleos doadores ocorrem pela exposição de tais componentes celulares à fitohemaglutinina.

1. RECONSTRUÇÃO DOS EMBRIÕES (FUSÃO DA CÉLULA DOADORA/OÓCITO RECEPTOR)

Para a reconstrução do embrião após a TNCS, o núcleo de célula doadora (carioplasto) é transferido para o interior de um citoplasma receptor (citoplasto). Cada célula doadora isolada individualmente com base no cultivo prévio é inserida no espaço perivitelino de um oócito enucleado para posterior estimulação com um pulso elétrico, o qual promove a fusão das membranas adjacentes. O pulso elétrico não somente induz a fusão da célula somática com o oócito enucleado para formar um novo complexo, mas também promove uma importante liberação de cálcio intracelular que inicia o processo de ativação.

1. DESENVOLVIMENTO

A transferência nuclear foi originalmente proposta por SPEEMANN (1938), sendo utilizada como ferramenta para conhecer o papel do material genético na diferenciação celular em anfíbios. Posteriormente, realizaram a primeira transferência nuclear em anfíbios e, subsequentemente, GURDON & COLMAN (1999) monstraram o potencial de reprogramação de células diferenciadas utilizando Xenopus adultos. Partindo da necessidade de aperfeiçoar a técnica, estudos subseqüentes permitiram verificar que células completamente diferenciadas poderiam ser usadas em programas de transferência nuclear. O ápice desta afirmativa aconteceu quando do nascimento da ovelha Dolly, o primeiro mamífero clonado por esta técnica (WILMUT et al., 1997). Posteriormente, o sucesso em outras espécies de ruminantes foi alcançado, já tendo sido observado em bovinos (KATO et al., 2000), caprinos (BAGUISI et al., 1999), gaur (LANZA et al., 2000), bubalinos (SHI et al., 2007), cervídeos (BERG et al., 2007), camelídeos (WANI et al., 2010), além de outras espécies animais. Dentre as várias aplicações da técnica, podem ser citadas aquelas que visam conhecer a interação núcleo-citoplasma na reprogramação nuclear. Além disso, a TNCS atende a programas de multiplicação de animais com características genéticas desejáveis (PEREIRA, 2010).

Embora animais de diferentes espécies tenham sido clonadas a partir de células somáticas em diversos laboratórios pelo mundo, o êxito na produção de clones por transferência nuclear continua bastante baixo. Além disso, grandes variações nos resultados acontecem frequentemente, apesar do uso das mesmas condições de clonagem, incluindo o tipo de célula, a ativação e o cultivo dos embriões. A baixa eficiência e a grande variação nos resultados decorrem dos diversos problemas que afetam os embriões produzidos por transferência nuclear, desde o estádio de pré implantação ate o desenvolvimento pós natal dos animais clonados(LAGUTINA et. al, 2005) pois é um processo que envolve complexa combinação de fatores tanto biológicos como técnicos que interagem entre si, muitos dos quais ainda não são compreendidos (WELLS et al., 1999).