Técnica de Coloração de Gram

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA
SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

Assunto: Técnica de coloração de Gram.

Ponta Grossa

2014

A técnica de coloração Gram é uma técnica de coloração diferencial que permite distinguir os dois principais grupos de bactérias por microscopia óptica e foi descoberta em 1884 pelo físico dinamarquês Hans Christian Gram, onde este cientista obteve  com a coloração realizada uma melhor visualização das bactérias em amostras de material  infectado.

Os dois grupos de bactérias que esta pratica detecta são: gram positivas e gram negativas. A técnica consiste em expor as células bacterianas destes grupos através do esfregaço bacteriano na lamina fixado com o calor da chama de Bunsen e realizando a seguinte sequencia de reagentes:

1. Cristal violeta: cora o citoplasma de púrpura, independente do tipo de célula.
2. Lugol: aumenta a afinidade entre o cristal violeta e a célula, formando com o corante um complexo insolúvel dentro da célula.
3. Álcool-acetona: age como solvente lipídico da membrana celular e na descoloração.
4. Fucsina ou safranina: age como contra- corante corando o citoplasma de vermelho.

Todas as bactérias sejam gram positivas ou negativas absorvem de maneira idêntica o cristal violeta e o lugol, adquirindo cor roxa. Entretanto, ao serem tratadas pelo álcool, apresentam comportamento diferente, isto é, as Gram-Positivas não se descoram pelo álcool e as Gram-Negativas se descoram facilmente. Dessa maneira, as bactérias gram-Positivas continuam com a cor roxa do complexo cristal violeta/lugol e as Gram-Negativas tornam-se descoradas. Ao receber a fucsina, somente as bactérias Gram-Negativas se deixam corar e adquirem a cor avermelhada do corante. É por isso, que quando se examina ao microscópio um esfregaço bacteriano corado pelo método de Gram, as bactérias Gram-positivas se apresentam de cor roxa e as Gram-negativas, de cor avermelhada.

[pic 1] Figura 1. Visualização de microorganismo gram negativo e gram positivo pelo microscópio óptico.

A absorção de diferente cor pelas bactérias se deve ao fato de estas se comportarem de formas diferentes devido à diferença em suas paredes celulares.

As gram positivas apresentam uma parede celular única que embora seja mais espessa é quimicamente mais simples, apresentando predominantemente um único tipo de macromolécula (90% peptidioglicano). Quando este tipo de bactéria entra em contato com a coloração de gram forma um precipitado insolúvel pela ação do lugol, fica retido no interior da célula pela camada espessa de peptidioglicano - responsável pela manutenção da célula e sua rigidez constituindo uma estrutura extremamente forte em tensão - logo, estas células não são descoradas permanecendo com a coloração conferida pelo cristal violeta (púrpura) e por serem de uma única camada retem apenas este corante, não adquirindo a coloração do segundo corante (fucsina).

Já as gram negativas são mais complexas, possuem parede celular mais delgada e apresentam uma segunda membrana lipídica, diferente da membrana plasmática. Ela é formada por uma ou poucas camadas de peptidioglicano – representa no maximo 5% da massa seca da célula formando uma estrutura frágil - e é separada da membrana lipídica (externa) por um espaço periplasmatico, contendo uma serie de enzimas e proteínas. Quando em contato com a coloração gram, o lipídio da membrana mais externa é dissolvido no álcool e libera o primeiro corante – cristal violeta – que estava solúvel nela e corando de vermelho pelo contrastante.