Relatorio bioquímico

2. Objetivo

2.1 Determinação do pka da glicina

A aula prática teve o intuído de analisar a eficiência do efeito tampão sobre a glicima, baseando-se no valor do pKa da mesma a cada interação. Por fim, concluir os resultados obtidos, construindo uma curva de titulação.

2.3 Determinação da atividade da arginase e inibição enzimática

O experimento realizado  teve o intuito de determinar a quantidade de  proteínas solúveis em um meio aquoso,utilizando o método de biureto.

3. Metodologia

3.1 Determinação do pka da glicina

Inicialmente, mediu-se o valor de uma solução de glicina 100 mM, que estava em um béquer, utilizando um pH metro e anotou-se o resultado obtido.

Com o auxílio de uma pipeta automática, acoplada com uma ponteira, mediu-se cerca de 100 uL de NaOH 10 M e adicionou-se na solução de Glicina, sendo que novamente anotou-se o resultado. O experimento foi repetido vinte e uma vezes, assim  o pH atinjiu um valor valor ≥ 12.

3.3 Determinação da atividade da arginase e inibição enzimática

O experimento foi realizado com um microtubo de 1,5 mL escrito CP, com um outro microtubo de 1,5 mL escrito TI e  com outros 5 tubos de ensaio , sendo que no primeiro foi escrito T1, no segundo T2 e assim por diante. Inicialmente pipetou-se, usando uma pipeta automática com uma ponteira, todos os reagentes da bancada, exceto a enzima, em alguns microtubos. A tabela a baixo esquematiza o experimento realizado.

Tabela 1: Preparo da reação enzimática e controle da reação.

	Controle Positivo (tubo CP)	Controle Negativo (tubo CN)	Inibição (tubo TI)
L-Arg 500 mM pH 9,5	200 μL	200 μL	200 μL
Inibidor	0	0	200 μL
Água	300 μL	300 μL	100 μL
Enzima Arginase	10 μL	0	10 μL

Em seguida adicionou-se a enzima no tubo TI e CP, sendo que ambos foram imediatamente incubados a 37o C por 15 minutos.

Enquanto esperava-se o tempo de incubação, nos tubos marcados de T1 a T5, foram pipetados, usando a pipeta automática com sua ponteira, 1000 μL de Reagente 1 (R1). Quando passou-se 10 min de tempo de incubação,  transferiu-se imediatamnete 10 μL da reação para 1000 μL do reagente 1 conforme Tabela 2:

Tabela 2: Análise do produto uréia formado.

	R1	amostra
T1	1000 μL	10 μL de água
T2	1000 μL	10 μL do tubo CP
T3	1000 μL	10 μL do tubo CN
T4	1000 μL	10 μL do tubo TI
T5	1000 μL	10 μL de uréia Padrão

Em seguida,Incubou-se a Mistura a 37o C por 10 minutos, após os 10 min adicionou-se 1000 μL de Reagente 2 nos tubos T1 a T5 e incubou-se a mistura novamente por a 37o C por 10 minutos. Ao termino do período de incubação ,as misturas foram levadas para o  espectrofotômetro, na qual foi zerada com a amostra T3 e mediu-se A600 de T1 a T5.