A FUNÇÃO DE CADA CICLO

CICLOS TÉRMICOS	FUNÇÃO DE CADA CICLO
DESNATURAÇÃO INICIAL	É muito importante para a reação, que as fitas de DNA molde alvo se separem completamente. Um aquecimento inicial da mistura a 950C é suficiente para desnaturar o DNA genômico e permitir o anelamento do iniciador, conforme a temperatura da reação começa a diminuir. Se o molde é apenas parcialmente desnaturado, haverá uma tendência das fitas se juntarem novamente muito rapidamente, evitando a eficiência do anelamento e extensão ou conduzindo a um “self-priming” com resultados falso-positivos. Usualmente, 20 a 30 segundos são suficientes, mas o tempo deve ser adaptado para o termociclador e tubos utilizados. A reação é então ciclada 20-45 vezes.
ANELAMENTO DO INICIADOR	Para a maioria dos objetivos a temperatura de anelamento tem sido otimizada empiricamente. A escolha desta temperatura é talvez o fator mais crítico para a obtenção de uma alta especificidade. Se a temperatura for muito alta, nenhum anelamento ocorrerá, mas se for muito baixa, o anelamento inespecífico aumentará dramaticamente. Em geral, uma temperatura de aproximadamente 55-65o C é mantida por 30-60 segundos.
EXTENSÃO DO PRIMER	A extensão do primer é normalmente conduzida a 720 C, temperatura ótima para a ação da TaqDNA Polimerase (explicada adiante). Usualmente, de 20 a 40 segundos de extensão são suficientes (1 minuto para cada Kilobase). Entretanto, esses tempos podem variar e também são alvos de otimização.
EXTENSÃO FINAL	Usualmente, depois do último ciclo, os tubos de reação são mantidos a 720C por 5-10 minutos para promover completa extensão e anelamento, e complementar de fitas únicas de DNA.
NÚMERO DE CICLOS	Para uma reação ótima, menos de 10 moldes alvo de DNA podem ser amplificados em menos que 40 ciclos para uma quantidade de produto facilmente detectável em gel corado com brometo etídeo. A maioria das PCRs deveria então incluir apenas 25 a 35 ciclos. Com o aumento do número de ciclos, aumentam também as reações inespecíficas. No protocolo acima, cada ciclo tem duração de 1 a 3 minutos; entretanto, tempo extra é necessário para o aquecimento e resfriamento entre os passos. Portanto, 25-35 ciclos de PCR estende-se por 2 ou 3 horas.

...