Curva padrao de proteínas

Protocolo da Aula Prática n°8

CURVA PADRÃO DE PROTEÍNAS

Objetivos:

• Reconhecer a importância dos métodos espectrofotométricos na determinação da

concentração de diferentes compostos;

• Elaborar uma curva de calibração e estabelecer a sensibilidade de um método

espectrofotométrico;

• Determinar a concentração de proteínas por meio de cálculos específicos envolvendo

diluições.

Fundamento: o método do Biureto, está baseado na formação em meio alcalino, de um

complexo entre o íon cúprico e as múltiplas ligações peptídicas das proteínas. O complexo formado

apresenta coloração violeta púrpura estável, cujo ponto máximo de absorção ocorre no comprimento

de onda de 545 nm (filtro verde).

O espectrofotômetro é um aparelho que permite a dosagem ou a determinação quantitativa de

um composto corado mediante a utilização da lei de Lambert-Beer. Esta lei estabelece que, dentro

de limites muito bem definidos, a intensidade da cor de uma solução corada é diretamente

proporcional a concentração de soluto nesta solução. A lei de Lambert-Beer, ou seja, a

proporcionalidade entre E (extinção) e C (concentração), permite escrever:

Sendo,

Cd = concentração desconhecida

Cp = concentração do padrão

Ed = extinção desconhecida

Ep = extinção do padrão

Onde,

Se forem consideradas as extinções obtidas a partir de várias concentrações conhecidas

diferentes, poderemos obter uma média de quociente Cp/Ep, o qual será denomiado de quociente

médio (Qm) ou fator de calibração médio (FCM). A série de determinações feitas com concentrações

crescentes de substâncias padrão denomina-se Curva Padrão, a qual é muito mais segura como

ponto de referência do que uma determinação padrão isolada.

Observações importantes:

• A sensibilidade do método do Biureto está entre 1,0 e 10 mg/mL;

• Determine os quocientes parciais. Calcule a média e compare o resultado com cada

quociente parcial. Desprezar os quocientes que se afastaram muito da média e

recalcule o quociente médio.

• Utilizando a extinsão dos dois tubos com a amostra desconhecida, calcule a

concentração de proteína para cada um;

• Ao construir o gráfico em papel milimetrado, observe que quanto mais próxima de 45°

for a reta,menores são os erros de leitura no gráfico;

• Quanto mais racionalmente você usar o papel milimetrado, mais facilmente você

poderá calcular a concentração da amostra desconhecida.

Determinação de curva padrão de proteínas pelo método do Biureto

Procedimento:

a) Dispor uma série de tubos conforme demonstrado abaixo: