A CINÉTICA ENZIMÁTICA

CINÉTICA ENZIMÁTICA - INVERTASE

A cinética enzimática pode ser entendida como sendo a velocidade com que um substrato é convertido em produto de acordo com o tempo. Esse processo acontece devido à existência de um sítio ativo nos complexos enzimáticos que pode estar acompanhado de um grupo prostético. Os sítios ativos são regiões da enzima em que a presença de diversos resíduos de aminoácidos faz com que ocorra a interação entre a enzima e o seu substrato.

Os valores da cinética enzimática podem ser obtidos através da equação de Michaelis-Menten, que é baseada em estudos que consideravam a cinética química e as concentrações de enzima livre (E) e substrato (S) pelo seguinte raciocínio (MARZZOCO & TORRES, 1999):

A equação final leva em conta a concentração de substrato [S], valores de Vmáx. e Km para determinar valores de V0 (LEHNINGER, 2006).[pic 1]

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Por meio dessa equação é possível obter a curva da velocidade inicial em função de [S]. É importante lembrar que essa curva fornece o valor do Km quando a V0 é igual à Vmáx./2 .Outra forma pela qual se pode determinar os valores já mencionados de forma mais precisa é por meio da construção do gráfico do duplo-recíproco de Lineweaver-Burk, em que  é 1/S plotado em função de 1/V . Experimentalmente, a determinação da velocidade da reação pode ser feita controlando-se a dosagem dos produtos, sendo de suma importância o controle do tempo transcorrido durante a reação dos reagentes.

OBJETIVOS

O propósito da atividade feita em laboratório teve como objetivo o estudo da atividade enzimática e de como as concentrações de enzima e substrato podem influenciar os valores de Vmáx.. e Km obtidos. Assim como, analisar as curvas obtidas experimentalmente e discutir a importância de cada parâmetro.

MATERIAL E MÉTODOS

Nessa aula prática, o grupo precisou fazer três procedimentos experimentais,definidos como: a construção da curva padrão,o efeito da concentração da enzima e o efeito da concentração do substrato. Para a construção da curva padrão, foram adicionados volumes de soluções de acordo com a Tabela 1, em seis tubos. Após esse procedimento, os tubos foram fervidos por dez minutos, resfriados em água corrente e posteriormente adicionamos 16mL de água destilada agitando com inversão vertical. Essa preparação foi necessária para podermos ler as absorbâncias a 540nm contra o branco e assim construir a curva padrão indicadora da quantidade de sacarose hidrolisada em µmol (Figura 1).

Para o efeito da concentração da enzima,o grupo utilizou sete tubos de ensaio com os volumes de reagente indicados na Tabela 2. Como nesse procedimento foi utilizado uma solução de enzima,foi preciso manter os tubos no gelo para que a reação não se iniciasse logo após a adição dessa. Após a retirada do gelo, os tubos foram agitados e colocados em banho-maria (37ºC) por cinco minutos,e depois seguiram novamente para o gelo, onde foram adicionados 2mL de DNS a cada tubo, fazendo com que a enzima parasse de funcionar. Após isso, os tubos foram transferidos para um banho-maria fervente por 10 minutos, resfriados, adicionados 16mL de água destilada e agitados. Com isso concluído, foi possível fazer a leitura das absorbâncias a 540nm e assim,construída a curva padrão da relação entre concentração de enzima e velocidade de hidrólise (Figura 2).

Por fim, para o efeito da concentração do substrato,foram utilizados sete tubos de ensaio e adicionados reagentes de acordo com a Tabela 3. Procedemos de modo idêntico ao do segundo experimento e,ao final,foi possível montar a curva padrão relacionando velocidade de reação com concentração do substrato (Figura 3).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na primeira parte do processo experimental foi construído uma curva padrão com base nos dados da tabela 1. As absorbâncias foram medidas no espectrofotômetro e a quantidade de sacarose hidrolisada calculada utilizando a fórmula C=m/v e a concentração de sacarose (6mM) . A equação calculada foi a seguinte: Y=0,066X + 0,119 (Figura 1).

                                                                                                   

Figura 1 : Dados utilizados e calculados na primeira parte do experimento.

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Tabela 1: Curva padrão do primeiro experimento.

Na segunda parte do experimento, utilizamos a equação anterior para calcular a sacarose hidrolisada e o tempo de reação (5 minutos) para calcular a sacarose hidrolisada por minuto. A concentração da enzima (20µ/mL) foi dada no início do experimento e a partir dela foi possível calcular a concentração de cada tubo. Esses dados se encontram na tabela 2.

Tabela 2: Dados utilizados e calculados na segunda parte do experimento.

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Figura 2: Curva padrão da segunda parte do experimento.

Na terceira parte do experimento, utilizamos a equação da primeira parte para descobrir  a quantidade de sacarose hidrolisada e usamos os 5 minutos para calcular a sacarose hidrolisada por minuto. Esses dados são apresentados na tabela 3 e a partir deles foi possível construir uma curva padrão apresentada na figura 3.

Tabela 3: Dados utilizados e calculados na terceira parte do experimento.

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Figura 3: Curva padrão da terceira parte do experimento.

         

        Através do gráfico foi possível estimar o valor de Km (0,02M) e o valor de Vmax. (0,51 mol/min). Para comparação foi feito uma gráfico de Lineweaver-Burk (figura 4).

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Figura 4: Tabela e gráfico em relação ao inverso da concentração e a velocidade da hidrólise de sacarose.

         Utilizando a equação da reta, foi possível calcular o Km (0,026M) e Vmáx (0,679 mol/min). O Km encontrado na literatura científica (VILLELA, 1961) se encontra entre 0,016M e 0,04M. Ambos os Km (o calculado e o estimado) estavam dentro da faixa encontrada.