A Microbiologia

1. INTRODUÇÃO

A Microbiologia é a Ciência que estuda os microrganismos, ou seja, os seres vivos de dimensões microscópicas, como células únicas ou como grupos de células. O seu nome tem origem grega, mikros (pequeno), bios (vida) e logos (ciência). Estuda-se na microbiologia as bactérias, os fungos, os protozoários e as microalgas; também estão incluídos os vírus.

A Biologia Molecular é o estudo da Biologia em nível molecular, com especial   foco no estudo da estrutura e função do material genético e seus produtos de expressão, as proteínas.  No estudo da Microbiologia, diversas técnicas de biologia molecular são utilizadas para o isolamento e caracterização de organismos patogênicos (ou de seus genes), como vírus e bactérias.  

Na microbiologia, a presença de determinadas espécies tem sido considerada fator de risco para doença periodontal e o desenvolvimento de diversas outras doenças infecciosas na região de cabeça e pescoço. Dentre esses microrganismos destacam-se os microaerófilos e anaeróbios obrigatórios, como:

Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Tannerella. forsythia, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia e Fusobacterium nucleatum entre outras (BROOK, 2007; BROOK, 2008).

Apesar da existência de métodos convencionais, como cultura, ensaios imunológicos e enzimáticos para a detecção de microrganismos específicos (LISTGARTEN, 1992), nenhum desses tem sido satisfatórios em termos de sensibilidade, especificidade e/ou confiabilidade (NOZAKI et al., 2001). Assim, novas tecnologias no diagnóstico microbiológico, como utilização de sondas de DNA e a detecção do DNA microbiano através da reação em cadeia da polimerase (PCR), têm expandido as possibilidades do estudo de uma grande quantidade de espécies com custos relativamente baixos. A possibilidade de se detectar os principais patógenos ou exógenos por métodos moleculares, de custo mais acessível, além de elevada sensibilidade e especificidade, facilitou alguns diagnósticos. Entretanto, todos esses métodos possuem vantagens e desvantagens e devemos respeitar essas peculiaridades como forma de extrair os melhores e mais confiáveis resultados.

Contudo, o objetivo principal deste trabalho é discutir as principais técnicas de biologia molecular aplicada à microbiologia. Fundamentando-se em técnicas de biologia molecular para substituição de técnicas básicas de microbiologia. Como exemplo, o antibiograma ou meio de cultura substituído por pcr, pcr em tempo real, clonagem e etc, na identificação de microrganismos.

 

1. DESENVOLVIMENTO

1. PCR

1. Hibridização de DNA/Sonda

A hibridação é um processo fulcral na área da engenharia genética. O uso de sondas deixa caracterizar e identificar DNA, baseando-se nas propriedades do mesmo, destacando-se o emparelhamento de bases por pontes de hidrogénio e a desnaturação e renaturação das cadeias complementares. Essas reações acontecem entre ácidos nucleicos independentemente da sua natureza, sendo apenas necessário que se encontre em cadeia simples (DNA: DNA, RNA: DNA ou RNA: RNA). A técnica de hibridação é importante para analisar genes expressos assim como os genes não expressos. A identificação destes genes de interesse se dá pelo emparelhamento das sondas que se encontram marcadas por radioatividade, por quimiluminescência ou por um anticorpo. São várias as técnicas de biotecnologia que utilizam a hibridação como princípio do método, como por exemplo, o Northern – Blot, Southern – Blot e Colony – Blot.

Reações de Hibridização de Ácidos nucleicos são à base de um método sensível para a detecção de sequencias nucleotídicas específicas em microrganismos

A hibridização DNA-DNA através de sondas permite a detecção de dezenas das espécies (as consideradas com maior probabilidade de ocorrer em um dado sítio anatômico). As sondas, por si, consistem em segmentos específicos de DNA, de fita simples, que reconhecem e hibridizam com sequências complementares presentes no genoma bacteriano, formando moléculas híbridas de fita dupla. O uso de sondas para as regiões hipervariáveis dos genes que codificam para o RNA ribossômico mostra-se como uma alternativa satisfatória para o diagnóstico preciso, sendo que a técnica continua sendo empregada, com poucas modificações, até o presente (COLOMBO et al., 2009). Entre os muitos potenciais sítios de amplificação o gene 16S rRNA aparece como o mais utilizado para reações de PCR e está presente na maioria das bactérias, sendo altamente específicos para cada espécie (KUBONIWA et al., 2004). Contudo, essa metodologia é bastante sensível a falhas experimentais e resultados falso positivos podem ocorrer com freqüência.

Para sua utilização, as sondas são marcadas com radioisótopos, enzimas ou moléculas quimioluminescentes, para que as moléculas híbridas possam ser identificadas após o teste. Esse método permite, também, a quantificação do DNA alvo, desde que o pesquisador possua uma curva padrão da quimioluminescência ou outro elemento quantificável proporcional à quantidade de DNA detectada. Assim, por comparações com diluições seriadas de uma amostra do DNA alvo, pode-se comparar com os dados obtidos com as diferentes amostras clínicas. Esse método permite o processamento de muitas amostras simultaneamente, mas possui o inconveniente de ter sensibilidade e especificidade inferiores aos métodos que envolvem a amplificação do DNA por PCR, além de necessitarem de infra-estrutura laboratorial complexa.

 

As técnicas de hibridização são:

Southern-blot: Análise do DNA transferido para a membrana;

Northern – Blot: Análise do RNA transferido para a membrana;

Dot-blot: Análise de colônias transferida para a membrana.

Southern-blot: técnica da qual fragmentos de DNA (enzimas), separados por eletroforese, são imobilizados por uma membrana. Moléculas especificas são então detectadas com uma sonda de ácido nulcleico marcada (radiação/fluorencencia).

O monitoramento microbiológico pode ser de grande importância nos casos de periodontites de progressão rápida, tão bem quanto aquelas que não respondem adequadamente ao tratamento periodontal convencional. As técnicas de biologia molecular para a detecção de periodontopatógenos apresentam alta sensibilidade, especificidade e segurança. A detecção por PCR e sondas de DNA é particularmente valiosa para microrganismos que não podem ser cultivados ou distinguidos com facilidade por meios de cultura.