A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

A PCR (Reação em cadeia da polimerase) é um processo de biotecnologia que consiste em copiar milhões ou bilhões de vezes uma sequência específica de DNA que é de interesse do pesquisador vinda de uma pequena amostra, e seu produto final tem várias aplicações diferentes.

Essa técnica laboratorial ocorre dentro de um tubo de ensaio, onde são adicionados à uma solução tampão, a amostra de DNA, a Taq Polimerase e uma quantidade muito grande de primers.

Da mesma forma que ocorreria na célula, é necessária uma enzima para que aconteça a formação da nova fita, porém as enzimas Polimerase encontradas nas células humanas não suportam temperaturas altas, assim, é usada uma enzima chamada Taq Polimerase. Essa enzima foi isolada de uma bactéria (Thermus aquaticus), que é encontrada em fontes de águas termais, assim sua DNA Polimerase é resistente à altas temperaturas e mais ativa em temperaturas de 70°C. E assim como as outras Polimerases, ela só consegue trabalhar no sentido 5’         3’.[pic 1]

Além da enzima Taq Polimerase, para que ocorra a fabricação do novo DNA são necessários primers, que são comprados previamente de uma empresa, uma quantidade enorme é utilizada para que a chance dos desses primers se ligarem aos DNA moldes seja maior.

Eles são formados por aproximadamente 20-30 bases nitrogenadas, e funcionam como um ponto de partida para que a Taq Polimerase comece a produção do DNA. Também fazem com que seja possível através das sequências de bases opostas às do DNA molde, escolher a região específica que será copiada, posicionando-os nas extremidades dessa região.

A PCR se divide em três etapas de aquecimento e resfriamento, e cada vez que essas etapas acontecem, elas correspondem a um ciclo. A primeira etapa é a desnaturação, ela ocorre em uma temperatura de 96°C, o que faz com que as pontes de hidrogênio sejam quebradas, separando as fitas de DNA. A alta temperatura substitui a função que a helicase teria se esse processo ocorresse na célula.

A segunda etapa é a de anelamento, ela ocorre na temperatura de 55 a 65°C, o que resfria a solução e permite que os primers se liguem a seus anticódons marcando as extremidades da parte alvo do DNA.

A terceira e última etapa é a de extensão, ela ocorre em uma temperatura de 72°C, o que faz com que a Taq polimerase se ative e comece a sintetizar as novas fitas de DNA incorporando os nucleotídeos a seus complementares.

Esse ciclo de três etapas, é repetido em torno de 35 vezes, o que dura um total aproximado de 4 horas (podendo ocorrer variação de tempo de acordo com o tamanho da fita de DNA a ser copiada). Se ocorrer da forma certa, o resultado são milhões de cópias de DNA, pois a cada ciclo a nova fita formada irá servir como molde no próximo ciclo, gerando assim um crescimento exponencial, a reação em cadeia propriamente dita.

São variadas as aplicações da PCR, ela é usada na biologia molecular, ciências forenses, diagnósticos médicos, seu resultado pode ser visualizado por eletroforese, ser clonado ou sequenciado. Por exemplo, pode ser analisado um gene ligado à uma doença, fazer teste de paternidade, identificação de suspeitos de crimes, verificar se há DNA de patógenos no corpo entre outros.

Umas das utilidades da PCR com mais destaque é a em ciências forenses. Com uma amostra mínima de DNA vinda de sangue ou tecidos, deixada em uma cena de crime por exemplo, é possível que os técnicos analisem marcadores genéticos, através da eletroforese em gel, obtendo assim uma “impressão digital de DNA”, que pode ser comparada com as de suspeitos ou vítimas. Com isso é possível a condenação de criminosos, mas também, a liberação de pessoas inocentes que foram acusadas injustamente. Além disso pode se identificar restos mortais de pessoas.