Expressao e purificaçao de proteinas

Expressão e purificação.

2.6 Expressão da PLD recombinante em E.coli.

E. coli pLysS transformadas com vetor pET28a contendo o gene codificador da PLD [A construção inclui uma cauda de hexa-histidina N-terminal e um sítio de clivagem de para TEV protease (ENLYFQG)] serão inoculadas em meio LB (com o antibiótico de seleção kanamicina 50 μg/mL), incubadas durante 16 horas, a 30 ºC, com agitação de 200 rpm. Posteriormente, vinte mililitros do pré-inóculo serão utilizado para inocular 2 L de meio de cultura Luria Bertani, (contendo a mesma concentração final de antibiótico de seleção) que será mantido sob mesma temperatura e agitação do pré-inóculo. Após alcançar a densidade ótica DO600nm 0,4, a temperatura será reduzida para 18 ºC e a indução da expressão será através da adição de 0,2 mM de IPTG (isopropil-β-tiogalactopiranosídeo), durante 16 horas.

2.7 Purificação das PLD sob condição nativa.

Após a expressão das proteínas, as células serão centrifugadas a 6000 x g, durante 10 minutos, a 4ºC e o sobrenadante será descartado. O pellet de bactérias será ressuspendido em PBS 1X e centrifugado novamente por 10 minutos, a 4 ºC, para eliminar restos de meio de cultura. Em seguida, as células serão ressuspendidas em tampão de lise (20 mM de fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, 40 mM de imidazol, 10% de glicerol, 1 mM de PMSF, pH 7.4) e serão intermitentemente sonicadas no gelo durante 10 segundos, com 10 segundos de descanso para o resfriamento da amostra. O tempo total de sonicação será de 2 minutos. O lisado celular será centrifugado a 15.000 x g, por 1 hora, a 4 ºC, e será passado na coluna com resina de níquel (Ni-NTA), previamente equilibrada com o tampão de lise para que as proteínas sejam adsorvidas. Após a adsorção, a resina será lavada utilizando gradiente de imidazol (10 mM a 80 mM) no seguinte tampão: 20 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 10% glicerol e 1 mM PMSF, pH 7.4, com o objetivo de remover contaminantes adsorvidos inespecificamente. Por fim, as proteínas serão eluídas utilizando tampão de eluição (20 mM fosfato de sódio dibásico, 500 mM NaCl, 400 mM imidazol, 10% glicerol e 1 mM PMSF, pH 7.4). Um último passo de purificação utilizando cromatografia de exclusão molecular será conduzido, com o objetivo de remover proteínas agregadas e trocar o tampão da amostra para 10 mM Tris HCl, 50 mM NaCl, utilizando-se a coluna Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare Life Sciences).

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