A Ação Enzimática

Relatório de Ação Enzimática

Rafaela Naegele e Thamiris Vitória

Curso de Engenharia Química

Bioquímica – Turma R161Q

Faculdade SENAI/CETIQT – Rio de Janeiro – RJ

Resumo. O presente relatório tem como objetivo, determinar de maneira prática a velocidade de uma reação enzimática, através do método da absorbância em utilização conjunta ao espectrofotômetro. 

1. Introdução:

As enzimas são proteínas especializadas na catálise de reações biológicas. Pode-se dizer que elas estão entre as biomoléculas mais notáveis devido ao seu poder catalítico e especificidade, afinal as enzimas são melhores e superiores do que os catalisadores produzidos pelo homem. Praticamente todas as reações que caracterizam o metabolismo celular são catalisadas por enzimas, sendo assim, consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular.

Os organismos biológicos são ricos em enzimas e as enzimas também funcionam fora dos organismos biológicos. Todas as proteínas são enzimas, mas nem todas as enzimas são proteínas. Como a proteína, a enzima apresenta blocos de construção chamados de aminoácidos.

São biocatalisadores utilizados em diferentes aplicações. As enzimas alteram a velocidade da reação, porque diminuem a energia de ativação do sistema.

Para determinar concentração de uma enzima, mede-se a velocidade da reação catalisada por essa enzima. Para isso, é preciso utilizar métodos analíticos que permitam medir o aumento na concentração do produto da reação ou a diminuição na concentração do substrato.

Há vários fatores que podem influenciar na atividade enzimática, dentre eles a temperatura, concentração de ativadores e inibidores, concentração de substrato, pH, concentração do produto. Essas variáveis devem ser controladas. Em alguns sistemas biológicos às vezes a presença de inibidores e ativadores não pode ser detectada, assim não podendo ser controlada. Com isso a medida da atividade enzimática não corresponde respectivamente à concentração real da enzima. Para se medir com precisão a velocidade de uma reação enzimática, deve-se manter constante esses parâmetros durante o experimento.

A influência de t, T, [E], [S] sobre a velocidade da reação enzimática será verificada com a utilização da enzima invertase, que catalisa a conversão (hidrólise) de sacarose que é um dissacarídeo a glicose e frutose que são monossacarídeos.

É possível determinar a atividade enzimática pela quantificação dos produtos formados através da reação com o DNS, já que, ao contrário da sacarose, a glicose e a frutose possuem poder redutor.

Assim obtendo a seguinte reação: Sacarose + água → glicose + frutose

[pic 1]

Figura 1: Reação química Sacarose + água → glicose + frutose.

1. Materiais:

• Agitador Magnético
• Água Destilada
• Becker
• Cubetas de Vidro
• DNS
• Erlenmeyer
• Espectrofotômetro
• Invertase
• Papel Filme
• Pipetas Automáticas
• Sacarose
• Solução de Glicose
• Solução Tampão
• Tubos de ensaio

1. Método Experimental:

• Curva de Calibração:

O experimento é baseado em duas etapas. Primeiramente são realizadas algumas reações redox entre glicose, a diversas concentrações, e DNS. Nessa primeira etapa é fornecido soluções com concentrações variadas do produto dessa reação. Isso foi realizado conforme descrito abaixo:

Tubo	Solução de Glicose (mL)	Água Destilada
Branco	0	1,0
1	0,2	0,8
2	0,4	0,6
3	0,6	0,4
4	0,8	0,2
5	1,0	0

Tabela 1: Dados para realizar a curva de calibração.

Primeiramente preencheu-se cada tubo com as quantidades de Solução de Glicose e Água Destilada descritas na tabela acima, após isso foi adicionado 1 mL do reagente DNS em cada tubo.

Deve-se aquecer os tubos os colocando em banho-maria por 5 minutos com a temperatura de aproximadamente de 100 °C. Depois de aquecer a solução deve-se resfriar a mesma e após resfriada completar o seu volume até 12 mL.

Após de se completar o volume para 12 mL, deve- se homogeneizar a solução e ler a sua absorbância no espectrofotômetro, para isso, coloca um pouco da solução de cada tubo em cubetas de vidro.

Deve-se colocar as cubetas de vidro dentro do espectrofotômetro com o lado translucido para a parte que passa a luz.

A absorbância é lida a 540µm, após zerar o aparelho com o branco da reação.

Pode-se observar que a glicose tem ação redutora, fazendo com que o DNS reduza para ANS. O DNS oxida a glicose, o que quantifica a glicose ser um açúcar redutor.

• Influência do tempo e da concentração da Enzima:

Na segunda etapa do presente experimento, o objetivo é calcular a velocidade inicial de uma reação enzimática e após isso verificar a influência da [E] na velocidade inicial de uma reação enzimática.

Deve-se numerar 7 tubos de 0 a 6. Após isso adicionar 1 mL de DNS em cada um dos tubos.

Colocar em um erlenmeyer de 25 mL, 5 mL de sacarose, 8 mL de solução tampão e por fim 2,0 de invertase.

Assim que se for adicionado a enzima deve-se homogeneizar e imediatamente retirar uma alíquota de 1 mL para o tubo 0 contendo DNS. Esse tubo será o branco e terá tempo de reação zero.

Repetir o mesmo processo de homogeneizar e retirar uma alíquota de 1 mL para os tempos de 3, 6, 9, 12, 15 e 20 minutos e colocar nos tubos respectivos.

Deve-se aquecer os tubos em banho-maria a uma temperatura de 100°C por 5 minutos.

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